高效实时检测单个活细胞1受肾上腺素刺激后1AAR运动.docVIP

实时检测单 shí shí jiǎn cè wèi1A -rén gōng yú jiāo cì jī de yùn dòngdān qù yǎng shēng huóCell1 ? 更好的翻译建议 Xu Ning1*, Liang Zhangyi2*, Xu Ming1, Guan Yinghua2, He Qihua3, Han Qide1, Zhao Xinsheng2**, Zhang Youyi1**1血管医学研究所，北京大学第三医院，并重点分子心血管科学，教育，北京，中国（100083）教育部重点实验室2国家实验室北京分子科学，结构的动态与稳态化学国家重点实验室，化学生物学和化学与分子工程学院，北京大学，北京，中国（100871）3医学分析中心，北京大学，健康科学中心，北京，中国（100083）E-mail：zhangyy@bjmu.edu.cn 摘要目的：调查运动的1A -肾上腺素受体（）的激动剂苯肾上腺素（PE）和受体的动态与毫秒，在活细胞中第一个实时活动中激发。方法：标记1A使用单克隆抗体Cy3—共轭山羊抗鼠IgG，记录了他们在theliving HEK293A由激动剂苯肾上腺素（PE）刺激细胞运输过程中的轨迹，然后分析了它们的动态特性。结果：1A的具体检测，对市民生活HEK293A表面- 1A条，敷设PE内在的刺激下后，刺激细胞与PE(1A型刺激了，明显的合作关系定位为1A至敷设，并发现架F -肌动蛋白。40后的PE，在HEK293A近似直线运动轨迹分刺激- 1A型细胞记录而且他们计算速度。结论：特定标记活细胞表面的方法，提供实时的表面行为实时检测手段方便。通过这种方法，我们能够明确地发现第1A –，记录与50ms的暴露在单个活细胞的实时时间行为的受体单个粒子。关键词：肾上腺素能受体;轨道;活细胞绪言膜受体往往发挥的生理和大量关键作用病理生理条件。这些受体的治疗药物的大量目标。可视化和跟踪激动剂刺激受体在活细胞，将有助于了解分子机理受体激活。但是，使用传统的生化技术是很难调查，实时单个活细胞受体的运动，因此它是不够的受体调控的研究。未来的研究，研究了受体贩卖动态特性，不仅将加强在受体细胞功能的理解，而且将有利于为新型药物的设计和改进对广大受体一系列相关待遇的条件。高节奏实时显微镜分辨率相信是在努力造成很大影响，了解蛋白质的功能[1]。最近，一个或几个分子检测技术已经在生命科学研究方面取得迅速进展。这些技术使我们能够记录实时单个粒子的行为[2,3]。由于受体的脱敏和内部已在实时成像研究生活在一分钟时间分辨率[4]细胞，现在的挑战是调查受体运动实时或迅速发生在单个活细胞的活动与动态毫秒的决议。1本工作由国家自然科学基金30490172）和NKBRSF（G1999075305）资助。对于这个目标，一个良好的标记方法和检测方法是非常重要的1 -肾上腺素受体国集团成员蛋白偶联受体（G蛋白偶联受体）的家庭。 1 -ARS发挥调解收缩，心脏和血管平滑肌细胞生长反应[5了重要作用]。独特的3个基因编码受体亚型，第1A -，1B至，和1D -ARS，已经被克隆和药理特点[6]。根据过去的调查，第1A受体表达不仅在细胞表面，而且在细胞质[7]。然后，我们标记由一种单克隆抗体标志使用杀伤和Cy3 -共轭山羊抗鼠IgG（Cy3免疫球蛋白）- 1A型ARS，并记录了高节奏的使用高分辨率荧光成像技术对他们的运输过程中的轨迹刺激受体激动剂肾上腺素（PE）。使用这种方法，我们能够明确地发现并记录表面受体的受体与50ms的单个粒子暴露在单一活细胞的实时时间的行为。我们先取得1A的轨迹，敷设内部的实时分析激动剂刺激了它的动力特性，而不是由经典生化技术或扫描分在这项研究中，我们已经制定了标记活细胞表面的受体和跟踪高节奏的使用高分辨率荧光成像技术在单个活细胞的内在受体的方法。这种方法可以提供对机制和受体运输动态特性研究的一些新的见解。钟的时间分辨率激光共聚焦显微镜的使用探讨。材料与方法细胞培养，转染，并选择稳定表达细胞FLAG标记的α1A在pDoubleTrouble载体（α1A-AR/pDT）机场铁路是由热心提供PE明尼曼教授肯尼思（Emory大学，美国）。人类胚胎肾293A细胞（引领293A）的传播，但有10％（5 / 5）胎儿在37牛血清，5％CO2的环境中培养液（Invitrogen公司）。 2000年转用脂质体转染试剂（Invitrogen公司）根据制造商的建议，细胞转染α1A- 24每小时铁构造细胞稳定表达α1A受体被选定的800微克/毫升经G418（Sigma）中α1a表达和受体的放射配体结合化验确定为如前所述[8]。 HEK293A -α1A细胞在细胞密度为105镀/毫升，就coverships保持在培养