实验四培养基的分装与细菌的接种.docVIP

课程名称：微生物学检验技术 授课专业：医学检验 学时：2学时 实验四 培养基的分装与细菌的接种 一、实验目的 1．掌握液体、半固体、固体培养基的分装； 2．掌握细菌在液体、半固体、固体培养基上的接种。 二、实验物品 接种环，接种针，酒精灯，试管架，无菌试管，无菌平板，菌种等 三、实验内容 ㈠培养基的分装 所有物品均应在使用前严格进行灭菌，在使用过程中不得与未经灭菌的物品接触. ⒈固体培养基的分装： 将灭菌的培养基熔化后冷却约至50℃，以无菌操作倾注于灭菌平板内，自然愈合，水平旋转，待冷凝固后翻转。 注意：倾注平板时切勿将皿盖完全开启，以免细菌落入。新制的平板水分较多，不利于细菌的分离，可将平板倒扣37℃30分钟使其表面干燥。 2.液体、半固体培养基的分装： 先开试管塞（小塞）再开三角烧瓶塞子（大塞），瓶口（管口）通过火焰2-3次，分装量为试管容量的1/3。半固体培养基要趁热直放。 注意：无菌试管和烧瓶，于开塞后及盖塞之前，口部应通过火焰3次，以杀死可能附着管口或瓶口的细菌。开塞后的管口及瓶口应尽量靠近火焰，试管及烧瓶应尽量平放，切忌口部向上和长时间暴露于空气中。 ㈡细菌的接种与分离方法 基本程序：灭菌接种环/针→待冷→沾取细菌→进行接种→灭菌接种环/针 ⒈接种环和接种针 是接种细菌的必备工具，由镍锘合金或白金丝制成，接种环直径约2-4mm，一个合格的接种环是正圆形，连接端没有空隙，接种针长约50-80mm。两端连接有一绝缘体的金属棒。接种针与接种环在使用前要在酒精灯的火焰上灭菌后使用 接种环——固体培养基和液体培养基的接种 接种针—— 半固体培养基的接种 ⒉接种与分离技术 根据标本的来源，培养目的及所用培养近的种类，采用不同的接种方法 ⑴平板划线法 对于混有多种细菌的临床标本或其他培养物，经过划线接种到固体培养基表面，划线起到分散作用，一般经18-24小时培养后可得到单个菌落，供细菌计数和纯培养用（挑选单个菌落，转移至另一培养基中，生长出来的细菌均为纯种，称为纯培养），分离纯培养是从临床标本中检查鉴定细菌非常重要的第一步，只有先从含有多种杂菌的标本中分离出目的菌纯培养，才能进一步对目的菌予以鉴定和研究 ①（曲线划线法）此法多用于含细菌量不多的标本或咽拭，棉拭等标本的细菌分离培养 方法： 先将标本或培养物涂于平板1/5处，然后用接种环自标本涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下移动，连续划成若干条平行线。平板培养基表面与接种环约呈45°，主要在于手指用力，自如划线。 标准：线条密而直，不重复，充分利用平板，两边都要划到，不可划破。 ②分区划线法 此法多用于脓汁,粪便等含菌量较多的标本的分离.其方法是首先将接种环灭菌后,沾取标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分(第一区),将接种环火焰灭菌,待冷却后只通过第一区3-4次后连续划线(为第二区),依次可共划线3-5区,每一区细菌数可逐渐减少,直到分离出单个菌落为止.刺到距管底约0.3-0.5cm处.本法多用于普通肉汤,蛋白胨,水等液体培养基的接种.其方法是接种环沾取菌种,倾斜液体培养基管,先在液面与管壁交界处研磨接种物(以试管直立后液体能淹没接种物为准), 2-3次塞好棉塞后轻轻混合即可. 细菌的培养方法 根据培养细菌的目的和培养物的特性培养方法分为一般培养法,二氧化碳培养法和厌氧培养法三种1.一般培养法 将已接种过的培养基,置37培养箱内18-24小时,需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基上生长.少数生长缓慢的细菌,需培养3-7天直至一个月才能生长.为使培养箱内保持一定湿度,可在其内放置一杯水.培养时间较长的培养基,接种后应将试管口塞棉塞后用石腊凡士林封固,以防培养基干裂.2.二氧化碳培养法 某些细菌,如牛流产布氏杆菌和胎儿弧菌等需要在含有10%二氧化碳的空气中才能生长,尤其是初代分离培养要求更为严格.将已接种的培养基置于二氧化碳环境中进行培养的方法即二氧化碳培养法,常用方法有以下几种:(1) 二氧化碳培养箱 可将已接种的培养基直接放入箱内孵育,即可获得二氧化碳环境(2) 烛缸法 将已接种的培养基,置于容量为2 000ml的磨口标本缸或干燥器内.缸盖或缸口处均需涂以凡士林,然后点燃蜡烛直立置入缸中,密封缸盖.待燃自行熄灭时,容器内约含5-10%的CO2 容器置37培养(3) 重碳酸钠-盐酸法 每升容积的容器内,重碳酸钠与盐酸按0.4g与3.5ml的比例,分别将两种药各置一器皿内(如平皿内),连同器皿置于标本缸或干燥器内,盖严后使容器倾斜,两种药品接触后即可产生二氧化碳3.厌氧培养法 目前常用的厌氧培养方法有厌氧罐法,气袋法及厌氧箱三种(1) 厌氧罐法 是目前应用较广泛的一种方法,共分为以下几种抽气换气法: 该法适用于一般实验室,其特点是较经济并可迅速建立厌氧环境.标本接种后,将平板放入