应用抗原捕获聚合酶链反应检测海产贝类中的甲型肝炎病毒.pdfVIP

应用抗原捕获聚合酶链反应 检测海产贝类中的甲型肝炎病毒 硕士研究生:宋桂荣 指导教师:高晓虹 副教授 专业名称 :流行病学与卫生统计学 摘 要 甲型肝炎 (简称甲肝)是一种呈全球性分布的传染性疾病，主 要经粪一口途径传播，水和食物是最常见的传播因素，其中污染了甲 型肝炎病毒 (Hepatitis Avirus,HAV)的贝类被生食或半生食已成 为，患甲肝的高危险因枷AV属小RN。病毒科肝病毒属，具有耐热、 耐冻、耐酸的特性，在自然界中能广泛地传播。贝类靠滤过摄入食物 时，能将污染水体中的HAV在体内大量富集，使贝类成为甲肝的传播 因素，给人类健康带来一定的威胁。由贝类引起的甲肝爆发屡见不鲜， 己成为一个严重的公共卫生问题。建立一种灵敏、特异、快速简便的 方法来检测贝类中的HAV是切断贝类传播途径及预防甲肝爆发的一项 重要措施。而以往的细胞分离培养法和直接核酸分子杂交法检测贝类 中微量的HAV，灵敏度和特异度都不高，且操作复杂。随着分子生物 学枯 术 的发 展 而 产 生 的 多 聚酶 链 反 应 (Polymerase Chain Reactio斌PCR)，为检测贝类中的。A、开辟了崭新的途邵 本研究使用了一种建立在抗体捕捉病毒颗粒基础上的反转录多 聚酶链反应 (ReverseTranscription-PCR,RT-PCR)，即抗原捕获 聚合酶链反应 (AntigenCapture-PCR,AC-PCR)来检测贝类中的HAV. 〔类样品是采目二宁海域的毛、、，一:、古:、}:、蛤，共，。份，取 鳃村肠消化腺分开检测，共 32组。使用}_海复华生物医学工程公司 主产的HAG基因检测试剂盒来进行检测。先从贝类匀浆 扣沉淀、浓集 HAV，然后用抗 HAV的单克隆抗体捕捉浓集液中的病毒，加热释放病 毒RNA后，再进行RT-PCR扩增，最后用聚丙烯酞胺凝胶电泳一银染来 判断阳性结果:同时将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳和聚内烯酸 胺凝胶电泳一溟化乙锭 CEB)染色分析。 经AC-PCR检测辽宁海域 16份贝类样品有4份为HAVRNA阳性， 阳性率为 2i;%。锦州产的贝类污染严重，3份均为阳性;毛蛇污染较 严重，了份中有2份为阳性:鳃组 父组阳性，肠消化腺组3组阳性。 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析和聚丙烯酞胺凝胶电泳一EB染色分析 均为阴性，而经聚丙烯酸胺凝胶电泳一银染显示 弓组标本为阳性。 AC-PCR法优于其它检测方法的特点是高灵敏度、高特异度和快 速简便。有研究报道人C-PCR的检测限为3-30个病毒颗粒，其灵敏度 远远高于其它方法。我们可以推测所检出的阳性贝类标本中至少存在 月个具有抗原性的完整病毒颗粒。AC-PCR另一优点是将免疫亲和捕捉 病毒的特异性与PCR的灵敏性结合起来，特异性高，因而可认为阳性 结果为扩增的HAV而不是其它病毒的非特异性反应。AC-PCR法比传 统 RT-PCR法简便、快速、无须费时费力地提取 RNA，再则实验中只 取贝类的鳃和肠消化腺进行检测，简化 了样品处理过程 ，减少了贝肉 中一些RT-PCR抑制物:AC过程能有效去除RT-PCR的抑制物。本实 验应用AC-PCR法在贝类中成功检出了HAVRNA，充分肯定了这一点。 AC-PCR中用单克隆抗体捕捉到的HAV应该是包被着蛋白外壳的完整 的HAVRNA，因此AC-PCR比传统RT-PCR能更准确区分病毒的感染性。 另外，采用灵敏的聚丙烯酞胺凝胶电泳一银染法检测扩增产物，可提 高灵敏度。 本文从我省沿海地区贝类中检出HAVRNA，表明我省部分海产贝 类中存在 HAV污染，生食或食用未彻底加热的贝类可能是我省甲肝发 生的一个重要的潜在危险因彩 总之，AC-PCR法灵敏、特异、快速简便，可用来检测贝类中少 量的病毒;并能快速、准确地确定甲肝的贝类传播因素，对控制甲肝 流行有重要意义。 关键词 贝类 聚合酶链反应 甲型肝炎病毒 DetectionofHepatitisAVirusinShellfishby AntigenCapture-PolymeraseChainReaction