阿维菌素高产菌株选育.pdfVIP

摘 要 摘 要 本论文首先介绍了阿维链霉菌生物合成的研究进展 由阿维链霉菌产生的阿维菌 素是目前发现的最有效的杀螨虫 寄生虫和节肢昆虫的药剂之一 它包括8 个组分 其中B1 组分最为有效 阿维菌素是一种次级代谢产物生物合成复杂 现在已对每一 步合成途径和其中重要的酶有所了解 随着分子生物学技术的发展 目前 人们已经 完成了阿维链霉菌全基因组的测定 找到了30 个与阿维链霉菌次级代谢有关的基因 簇 掌握了整个阿维菌素合成的主要基因簇 这些使人们更加便于从分子角度对阿维 菌素的生物合成进行调节 以获得高产高效的阿维链霉菌 另外许多新的选育技术也 应用于阿维链霉菌菌种的选育 本实验室已应用我国的成熟的离子注入技术选育并获 得高产阿维链霉菌 另外 随着宇航技术的成熟 越来越多的人认识到太空复杂的环 境是地球上所无法比拟的 其产生的诱变效果也是地球上无法比拟的 因此应用宇航 搭载技术筛选高产生产菌株吸引了越来越多人的关注 在试验中发现铵离子对阿维菌素的生物合成有强烈的抑制作用 且铵离子可增加 阿维菌素 A 组分的百分含量 因此获得对铵离子有较高耐受能力的菌株 则可增加 阿维菌素的产量及提高B 组分的比例 另外已经证实阿维菌素A 组分C5 位氧甲基由 甲硫氨酸提供且甲硫氨酸可促进 S-腺苷甲硫氨酸 SAM 的合成 故希望通过选择 利用甲硫氨酸能力较强的菌株 使甲硫氨酸尽可能用于能量代谢 从而减少SAM 前 体的供给 以获得 B 组分含量较高的菌株 由磺胺药物的作用机制可知 对磺胺敏 感的菌株转运一碳单位的能力也可能相对较弱 因此其体内SAM 含量可能相对较低 这样的菌株所合成的阿维菌素中 B 组分的含量可能会有所提高 基于这三方面的考 虑 本试验首先将经过离子注入诱变的高产菌株 Z138 经亚硝基胍诱变后分别做耐 CsCl 耐甲硫氨酸和对磺胺敏感菌株的筛选 得到高产且效价稳定的5株菌株 它们 D5D677和73效价分别为4974g/mL 4214g/mL 4930g/mL 4410 是A22 g/mL 4369g/mL 比出发菌株分别提高64.87% 28.48%51.58% 16% 15% 又通过对经离子注入诱变和亚硝基胍双重诱变的阿维链霉菌 Streptomyces avermitilisHY1进行飞船搭载后 共分离纯化单菌落1237株 发酵测定618株菌 经过初筛和复筛 得到了24株高产且遗传性状稳定的菌株 这24 株高产菌株的总效 摘 要 价都比出发菌株HY1 提高24% 以上 最高的提高了83% 同时 用薄层层析法和HPLC 法筛选B1a组分较高菌株 最终得到组分优化的高效菌株2株 其中菌株HY365的总 效价为5924.67g/mL 它的B1a含量为3892g/mL 占总效价的比例达到65.74% HY516的B1a组分的含量为3076g/mL 占总效价的59.9% 在进行B1a组分较高菌株筛选的同时又对高产菌株HY365进行了发酵培养基的优 化 发现玉米淀粉和花生饼粉对发酵结果影响极大 找到了适合HY365的培养基组合 7 另外还进行了前体物质对菌体发酵效价影响的试验 发现发酵时在培养基中加入 一定浓度的前体物质丙酸钠 可以显著提高发酵产量 其中在培养基中加入 2.5mmol/L的前体物质丙酸钠 发酵产量可达到6424g/mL 关键词 阿维菌素 飞船搭载 诱变 前体物质 Abstract Abstract The avermectins from Streptomyces avermitilis are the most effective agents to kill helminthes, nematode and arthropod parasites at present. They are eight components, and the B1 com