传染性法氏囊病病毒上海超强毒株VP2-4-3基因真核表达质粒构建与表达.pdfVIP

传染性法氏囊病病毒上海超强毒株VP2-4-3基因 真核表达质粒的构建与表达 摘 要 鸡传染性法氏囊病 是由鸡 传染性法氏病病毒 Infectious Bursal DiseaseVirus, IBDV所 引起的一种烈性接触性传染病 病毒主要侵染和破坏机体的免疫器 官 引起严重的免疫抑制 近年来 由于鸡传染性法氏囊病病毒超强 毒株 very virulent IBDV, vvIBDV的出现 使得该病的发生和流 行出现了新的特点 传统的疫苗不再能提供足够的保护 使得 IBDV 的预防和控制成为一个新的难题 国内外对IBDV的分子生物学已进 行了一定的研究 并把研究的重点放在宿主主要保护性抗原蛋白 病毒结构蛋白VP2基因上 最近的研究发现 VP3在病毒颗粒的形成 中起稳定作用 为 IBDV衣壳正确装配和形态发生所必需 因此 VP2-4-3全序列的表达可能有利于VP2构象性抗原表位的暴露 形成 具有天然构型的VP2蛋白 从而可以达到更好的免疫效果 本研究应用本实验室分离 鉴定的IBDV上海超强毒株SH95经 口服和滴鼻感染IBDV非免疫鸡 采集发病鸡的法氏囊 通过差速离 心和密度梯度超速离心提取 纯化病毒 应用本实验已建立的蛋白酶 K消化法获得了该病毒的全长基因组dsRNA经琼脂糖凝胶电泳检测 呈现为3.2kb和2.8kb的A片段和B片段两条带 I 为了获得IBDV上海超强毒株VP2-4-3全长基因 在应用蛋白酶 K消化获得高纯度的dsRNA后 参照本实验室已建立的方法应用随机 引物合成了cDNA第一链 参照基因库中相关IBDV毒株的基因序列 设计了1对引物 应用long and accurate PCR(LA-PCR)技术一步扩 增出IBDV上海超强毒株全长基因组cDNA的VP2-4-3基因 为了构建鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 VP2-4-3基因的真核表 达质粒 应用Mlu和Xba对获得的VP2-4-3基因进行双酶切 通 过基因重组技术 将IBDV SH95的多聚蛋白VP2-4-3基因克隆入带有 原核复制原件和真核表达启动子的表达载体pALTER-MAX中 构建成 功真核表达质粒 pALTER-MAX-VP2-4-3 通过 PCR鉴定和酶切鉴定 排除了假阳性和多联体的可能性 最后进行测序鉴定 序列分析显示 它与基因库中的OKYM毒株的同源性在98%以上 通过脂质体介导 将纯化的 pALTER-MAX-VP2-4-3质粒转染 Marc-145细胞 经免疫荧光技术检测 其能够被抗IBDV抗体特异识 别 在细胞中观察到有特异蛋白质的表达 表明转染后多聚蛋白基因 获得了表达 表达的蛋白具有免疫反应性 为研制新型 高效的VLP 疫苗和DNA疫苗奠定了基础 关键词 鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 VP2-4-3基因 真核表 达质粒 基因表达 II CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF RECOMBINANTS OF VP2-4-3 GENE OFVERY VIRULENT IN DISEASE VIRUS ISOLATED FROM SHANGHAI ABSTRACT Infectious bursal disease (IBD), caused by infectious bursal disease virus (IBDV), is a highly contagious and restricted disease of young chickens. The virus causes a severe immunosuppression leads to an increased susceptibility to o