SUR1过表达实验设计方案.docxVIP

SUR1过表达实验设计方案一实验目的：使SUR1基因在植物体内超表达二实验方法：三实验步骤RT-PCR将RNA反转录成CDNARNA提取（-70℃保存）组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min10000 rpm 4℃离心15min转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min12000rpm 4℃ 离心15min倒掉上清，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，10000rpm 4℃ 离心5min倒掉上清，室温或37℃放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥加20ul DEPC水至EP管中在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解逆转录以Fernentas试剂盒为例，反应体系20ulRNA短暂离心将11ul的DEPC水和RNA（1ug）放入EP管内，置于冰上，使RNA终浓度为0.5ug/ul,再加入Oligo(dt) 1ul,轻轻混合均匀，短时间离心(RNA=1/总RNA浓度=1/ OD260×6 ；DEPC水=11-RNA)将反应液置于65℃ 5min 冰上1min,短时间离心按顺序加入：5×buffer 4u