苹果酸-乳酸酶基因克隆 及其在酿酒酵母中表达.docVIP

Oenococcus oeni苹果酸－乳酸酶基因克隆 及其在酿酒酵母中的表达* 中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(12):50～55 刘延琳1蒋思欣2何秀萍2李华1张博润2** （1 西北农林科技大学葡萄酒学院杨凌7121002 中国科学院微生物研究所北京100080） 摘要苹果酸－乳酸酶是苹果酸－乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌SD2a的苹果酸－乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上, 以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件，以大肠杆菌－酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒并转化酿酒酵母YS58。酵母转化子用SD/Ura平板筛选鉴定。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中, SDSPAGE检测表明获得的转化子表达了约60kDa的目标蛋白。获得的转化子在添加了L苹果酸的培养基中培养4d；取培养液上清用HPLC检测L苹果酸及L乳酸含量，采用t检验进行差异显著性分析，结果表明mleA基因进行了功能性的表达，将L苹果酸转化成L乳酸，L苹果酸和L乳酸含量分别与对照差异极显著和显著，苹果酸的相对降低率平均为20.95%。 在有选择压力条件下，重组质粒相对稳定，而在无选择压力条件下，传代培养10d后大约有65%的重组质粒丢失。 关键词酒酒球菌苹果酸－乳酸酶基因转化表达 收稿日期：