ELISA及び前処理技術手法の開発ア研究目的土壌中POPs.pdfVIP

（２） ELISA 及び前処理技術手法の開発 ア 研究目的 土壌中POPs による農作物の汚染を防止・低減するための技術開発や危害要因によるリス ク管理を行う上で、危害要因を簡易に検出する技術の確立は不可欠であり、土壌からの抽 出・濃縮・精製・測定までを一貫して迅速かつ簡便に行う方法の開発が求められている。 本課題は POPs 指定物質のうち過去に農薬登録のあった 9 物質及びPOPs 指定の可能性があ る物質を対象としたELISA 法等免疫反応を利用した簡易・迅速検出法の開発と妥当性確認 を行うことを目的とする。最終的に、現場対応型POPs の簡易検出法（試料調製法と免疫反 応を利用した測定法）を開発する。 イ 研究方法 (ア) 土壌抽出液の調製 ａ 振盪抽出法 Sakai ら1）の報告に従い、土壌6g （乾燥重量）を30 ml （固液比1 ：5）の 50％メタノー ル/水に懸濁し、24 時間の往復振盪した後、遠心分離し上清を抽出液とした。 ｂ 超音波抽出法 土壌6g （乾燥重量）を30 ml （固液比1 ：5）の 50％メタノール/水に懸濁し、10℃、40 KHz、 30 分間の超音波処理した後、遠心分離し上清を抽出液とした。 (イ) 土壌抽出液の精製 グラファイトカーボン/アミノプロピルシリル化シリカゲル積層ミニカラム(500 mg/500 mg/6mL) とグラファイトカーボンミニカラム(250 mg/6mL) を用いて検討した。 (ウ) 市販ELISA キットの評価 入手可能であったEnviroGard Chlordane in Soil Test Kit (SDI Inc.社製) とCyclodienes ELISA Kit (ABRAXIS LLC.社製)の有効性を評価した。 (エ) 抗体の作成 Manclús ら2）の報告を参考に、1,2,3,4,7,7-Hexachloronorbornene 誘導体をハプテンと する BSA コンジュゲートを免疫原としてウサギポリクローナル抗体とマウスモノクローナ ル抗体の作成を行った。 ウ 研究結果 (ア) 土壌抽出液の調製法と精製法 ａ 振盪抽出法にて調製した抽出液にディルドリン標準液を加え 0.2 ppm 溶液とした 後、その 4 倍、8 倍、16 倍希釈液を市販 ELISA キットにて測定した結果を図 12302-1 に示 したが、抽出液そのものでは、土壌の種類によりマトリックスの影響が異なり、測定値の 信頼性は得られないことが判明した。 図 12302-1 土壌抽出液の ELISA による希釈評価 - 1 - ｂ 抽出液の精製にグラファイトカーボン/アミノプロピルシリル化シリカゲル積層 ミニカラム(500 mg/500 mg/ ６mL)の適用を検討した結果、土壌１g 分の抽出液 5ml をカラ ムに添加した後、50％メタノール/水 15 ml で洗浄し、100％メタノール 10 ml で溶出させ る事で、図12302-2 に示す様に測定値を下げる成分を除去可能であることが確認できた。 図 12302-2 カラム精製液の ELISA による希釈評価 ｃ グラファイトカーボンミニカラム（250 mg/6ml）でも測定値を引き下げる成分の 除去に有効である事が確認でき、土壌 2g 分の抽出液 10 ml をカラムに添加した後、50％メ タノール/水10 ml で洗浄し、100％メタノール2.5 ml の小容量で回収する方法を確立した。 ｄ 24 時間の振盪抽出法に代わる時間短縮が可能な抽出法として超音波抽出法を検 討した結果、植物中のディルドリン濃度と土壌抽出液中のディルドリン濃度との相関に関 して、振盪抽出法と同等の結果が10℃、30 分間の超音波処理により得られる事を見出した （図12302-3）。 図 12302-3 超音波抽出法による土壌抽出液中と植物中のディルドリン濃度の関係 ｅ 超音波抽出は振盪抽出よりもELISA に影響する成分の溶出を4 割程抑える事も判 明し、超音波抽出法はこのELISA に適した前処理法と考えられる。 (イ) 市販ELISA キットの評価 購入可能なドリン系農薬の ELISA キット2 種類の内、定量用ELISA キットは 1 種類