FSH通过激活ERK12调节仔猪睾丸支持细胞GDNF表达.pdfVIP

FSH 通过激活ERK1/2 调节仔猪睾丸支持细胞GDNF 的表达1 1，2 1，2 1 1 1，2* 孙燕 ，王鲜忠 ，高小燕 ，白汝岚 ，张家骅 1 西南大学牧草与草食家畜重点实验室，重庆（400716 ） 2.西南大学动物科技学院，重庆（400716 ） E-mail ：j.zhang@ 摘 要：以体外培养的4周龄仔猪睾丸支持细胞为研究对象，研究了FSH在对GDNF蛋白的调 节作用及信号传导机制。结果显示：（1 ）外源性添加FSH可促进GDNF蛋白表达，且这种促 进作用具有浓度和时间依赖关系：当FSH浓度为50 ng/ml、作用1h 时，GDNF水平达到最高； （2 ）FSH （50ng/ml ）或dbcAMP （100µM ）处理支持细胞，可迅速激活MEK激酶，随FSH 刺激时间的延长，ERK1/2活性逐渐升高（0-2h ）；（3 ）加入MEK1/2的抑制剂U0126 ，则显著 抑制了FSH对GDNF的激活作用，GDNF蛋白表明FSH对GDNF的诱导依赖于MAPK。研究结 果表明，FSH在诱导GDNF蛋白表达的过程中，通过cAMP-PKA-ERK1/2级联通路，促进GDNF 基因的表达。 关键词：FSH ，支持细胞，GDNF 蛋白，ERK1/2 中图分类号：S828.3 文献标识码：A 胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF ）是支持 细胞在 FSH 调控下合成分泌的在调节支持细胞增殖和精原细胞增殖分化的重要的内部调节 因子[1,2] 。有研究表明，FSH 联合 GDNF 可刺激初生的大鼠睾丸支持细胞增殖，而 LH 或睾 酮联合 GDNF 却不具有该种促进作用[3] 。Yomogida [4] 的研究发现，当支持细胞异常地超表 达 GDNF 时，会引起生殖干细胞的积聚和异常扩充。GDNF 的表达受到促卵泡激素（FSH ） 的调控，这就暗示了 GDNF/FSH 信号通路调控着生殖干细胞的数量及其分化。但尚没有发 现关于 FSH 对 SC 细胞 GDNF 表达的影响及其调节机制的报道。因此，我们在研究 FSH 对 GDNF 蛋白表达的影响基础上，采用信号传导路径中的抑制剂，对 FSH 调控 GDNF 表达的 信号通路进行了研究。 1. 材料与方法 1.1 实验材料 睾丸采自重庆本地 2～3 周龄仔猪。 1.2 主要试剂 GDNF 抗体、ERK1/2 抗体、p-ERK （E-4 ）购自 Santa Cruz Biotechnology； DMEM/F-12 购于 Hyclone 公司；dbcAMP 、U0126 、FSH 为 Sigma 公司产品。 1.3 实验方法 1.3.1 SC细胞的培养 将分离制备的 SC 细胞通过活率鉴定（0.4% 曲利本蓝）后进行培养。接种密度为：蛋白 印迹实验为 2×106 活细胞/培养孔；RT-PCR 实验为 3-4×106 活细胞/培养孔。细胞培养条件 为 37℃、95%空气和 5%CO2。培养过夜，按实验要求处理细胞。实验使用的培养液均为无 1本课题得到教育部博士学科点专项基金(No ．20040625004)和重庆市教委项目(KJ060314)的资助。 -1- 血清培养液。 1.3.2 FSH对支持细胞GDNF表达的影响 每天在加入 FSH 前对一定量的培养细胞进行细胞计数，存活细胞数不少于 1×108 细胞 /ml ，方符合要求。支持细胞分为 5 组，培养 48h ，以不同浓度的FSH ，即 0、25ng/ml、50ng/ml、 100ng/ml、200ng/ml 加以刺激，4h 后收集各组细胞检测 GDNF 蛋白的表达。每个处理设三 个重复。 再用适宜浓度的 FSH 刺激支持细胞，分别在刺激的 0、15min、30min、1h、2h、4h 、