HCLV在PK-15细胞中的滴度和12nt的变化.pdfVIP

维普资讯 中国畜牧兽医 2007年第 34卷第 12期 生物技术 ·59 · HCLV在 PK-15细胞 中的滴度和 12nt的变化 亢文华 ，郝俊峰 。潘春刚 ，宁宜宝。 (1．中牧股份实业有限公司 ，北京 100070；2．中国科学院生物物理研究所 ，北京 100101； 3．中国兽医药品监察所 ，北京 100081) 摘要 ：在 PK一15细胞上连续传代获得的 HCLV，从第 1～25代病毒的测序结果一致 ，同源性为 100 。从第 26代开始在 12～nt(ttttttctttttt)插入处 出现变化 ，第 26、27代在 69位碱基 C的左右各多插入了一个 T；第 28、29代在碱基 C的右侧多插入 了2个 T；第 3O、31代在 C的左侧多插入 了6个 T，碱基 C也变成 了T；第 32、33代在 C的右侧缺失 了2个 T，碱基 C也缺失 ； 第 34代在 c的左侧缺失了5个 T，在 c的右侧缺失了5个T，碱基c也缺失，并且在第 86位 由原来的A变成G，第 92位由原 来 的T变成 C。将 HCLV 1～34代病毒接种 24孑L板中长满单层的 PK一15细胞 ，于接种后 72h进行荧光抗体检查 ，比较不同 代次 HCLV在 PK一15细胞上增殖的差异。结果发现，从 28代开始病毒滴度有所下降。 关键词 ：猪瘟兔化弱毒株 ；3’端非编码区；RT—PCR；序列测定 中图分类号 ：$852．65 1 文献标识码 ：A 文章编号 ：1671-7236(2007)12-0059—02 早在 20世纪 60年代 ，由中国学者发明的中国 (HCLV株)在细胞上的增殖复制情况 的了解却 比 猪瘟兔化弱毒疫苗就开始在我国广泛使用并传到国 较少 。因此本试验选用 PK一15细胞 ，将 HCLV 株 外 ，其优 良的免疫效能有效 的控制了猪瘟在我国的 在 PK一15细胞上连续传代 34代 ，以期 了解每一代 急性发生和大流行。到 70年代末和 80年代初 ，我 病毒的增殖情况和插入标志 12-nt的变化 。 国猪瘟的流行特点发生 了重大变化 ，以温和型猪瘟 1 材料与方法 和母猪持续感染引起的流产 、死胎 、新生仔猪死亡为 1．1 材料 PK一15细胞系由中国兽医药 品监察所 主 ，疫点虽显著减少，但病程变长 。近几年 ，我 国猪 鉴定保存 ；猪瘟兔化弱毒疫苗株 (HCLV株)，为兔 瘟的发生又呈上升趋势 ，表现更加复杂 ，既有区域性 体 480代 ，在牛原代睾丸细胞传代 3代后收获 ，由中 大流行 ，又有零星散发 ，既有高死亡率的急性症状 ， 国兽医药 品监察所保存 ；Trizol，SuperScript Ⅲ， 又有持续感染的温和型症状 ；许 多猪场 的免疫猪群 PfuUltraTM H igh—Fidelity DNA Polymerase，Taq 频繁发病，甚至将疫苗剂量加大数倍或数十倍 ，或更 酶等均购 自纽英伦生物技术有限公司。 换使用不同厂家的C株组织苗 ，疫情依然不能完全 1．2 病毒纯化 HCLV株在 PK一15细胞上连续传 控制。从而有人对传统弱毒疫苗提 出了质疑 。随着 代 34代 ，将 1～34代每一代分别超离纯化。Trizol 传代次数的增加和对不 同细胞 的适应性繁殖 ，疫苗 提取总 RNA，进行 RT—PCR，将 PCR产物克 隆入 毒株可能发生抗原漂移 I力Ⅱ之数十年来猪瘟病毒在 pMD18一T载体 ，然后转化 TOPIO感受态细胞，对重 大规模免疫接种压力下可能出现抗原变异。 组质粒进行双酶切和 PCR扩增鉴定 ，鉴定为阳性 的 猪瘟病毒基 因组 的 3’端存在 一个非编码 区