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基因表达载体的构建——核心 * 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 (一)、目的基因主要是______________________ 编码蛋白质的基因 请举出三个以上的例子 （二）、获取目的基因的常用方法有哪些? 1、从基因文库中获取 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成 请阅读P8、9第一和二两段 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 1.基因文库：概念见P9 2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类 种类 基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库 3.基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 4.获取目的基因的根据： 见课本P9 （一）基因文库的构建 （1）基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 用适当 限制酶切割 许 多 DNA片段 与载体连接 导入受体菌群 该生物基 因组文库 （每个受体菌含有一段不同的DNA片段） （2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成 与载体连接 导入受体菌群 mRNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA (cDNA) 该生物 cDNA文库 1、 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 2、原理： DNA复制的基本原理 (二)利用PCR技术扩增目的基因 四种脱氧核苷酸 一对引物： 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 模板DNA( 需含有目的基因 ) 4、条件： 一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补 一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 3、前提： 温度控制 IMN 变性 复性 延伸 5/ 3/ G—G T—C 3/ 5/ A—G C—C 5/ 3/ 引物Ⅱ G—G 变性 复性 延伸 1、变性(90---95度)：目的基因DNA受热变性，解链为单链； 2.复性（55---60）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合； 3.延伸（70---75）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，从5′端→3′端进行延伸。 5/ 3/ A—G 引物Ⅰ 5、扩增过程 PCR技术扩增过程 a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成_______ b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，从引物的______________________延伸，合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 5′端→3′端 （三）通过DNA合成仪用化学方法人工合成 1.蛋白质的氨基酸顺序 mRAN 核苷酸序列 基因DNA的核苷酸序列 目的 基因 推测 推测 合成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。 2.反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 —— 核心 3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 (二)基因表达载体的构建 质粒 DNA分子 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。 质粒 目的基因 限制酶 DNA连接酶 重组DNA 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的