凝胶层析法测定蛋白质分子量.docVIP

凝胶层析法测定蛋白质分子量 [原理] 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。 由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入。因此，在洗 脱过程中，大分子物质必然先于小分子物质向下移行，先流出的是大分子物质，小分子物质后流出，从而达到分离的目的。测定生物大分子的分子量是凝胶层析法的重要用途之一。用于分子量测定的凝胶有交联葡萄糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。 根据凝胶层析原理，对同一类型化合物的洗脱特征与组分的分子量有关。流过凝胶柱时，按分子大小顺序流出，分子量大的走在前面。实验研究表明，在凝胶分离范围之内，蛋白质分子量与洗脱位置之间存在线性对应关系。洗脱体积Ve是该物质分子量对数的线性函数，可用下式表示： Ve =K1－K2 logMr 式中 K1与K2为常数，Mr为分子量。 测定方法有两种，一种是上柱样品中一次包括几个标准蛋白质，洗脱后分出相应的几个峰。根据峰顶端对应的洗脱体积算出各标准蛋白质的Ve，这样一次过柱就可 以制作标准曲线。将已知的标准蛋白质走完后，再在已知标准混合样品中加入未知样品，过柱后出现的新峰就属于未知样品，测出未知样品的Ve，通过标准曲线找 出对应的分子量。这种方法叫做内插法。另一种方法是一个标准蛋白过一次柱，经几次过柱后得到对应的Ve，画出标准曲线。将已知的标准蛋白质走完后，再测未 知样品Ve，求出对应的分子量。这种方法叫做外插法。 本实验使用Sephadex G-75，采用内插法进行。 ? [方法和步骤 ] 1、凝胶预处理 （1）称取凝胶干粉12g，放入250mL烧杯中，加入过量的水，室温浸泡24h，或沸水浴浸泡3h。 （2）溶胀平衡后的凝胶用倾泻除去细颗粒。其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分搅拌，以防止颗粒破碎），放置数分钟，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉，浮洗3～5次，直至上层没有细颗粒为止。 （3）将浸泡后凝胶抽干，用300mL洗脱液平衡1h，减压抽气10min以除去气泡。 2、装柱 （1）将层析柱垂直装好，在柱内先注入1/4～1/5的水，底部滤板下段全部充满水，不留气泡，关闭柱出口，出口处接上一根长约1.5m，直径2㎜细塑管，塑管另一端固定在柱的上端约45㎝处。 （2）插入一根直径稍小的长玻棒，一直到柱的底部。轻轻搅动凝胶（切勿搅动太快，以免空气再逸入），使形成均一的薄胶浆，并立即沿玻棒倒入层析管内，一边灌凝胶，提升玻管，直至充满整个柱时将玻管抽出。待底面上积起约1～2㎝的凝胶床后，打开柱出口。 （3）随着下面水的流出，上面不断加凝胶，使形成的凝胶床面上有凝胶的连续下降。（如果凝胶床面上不再有凝胶颗粒下降，应该用搅拌均匀地将凝胶床搅起数厘米高，然后再加凝胶，不然就会形成界面，不利于以后的工作。） （4）当凝胶沉积到柱的顶端约6㎝处，可停止装柱。 （5）用眼睛观察柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。若层析柱不均一，必须重新装柱。 3、平衡 柱装好后，使层析床稳定15～20min，然后连接恒压洗脱瓶出口和层析柱顶端，用3～5倍体积的洗脱液平衡层析柱，平衡过程中维持操作压在45㎝水柱（图）。 4、上样与洗脱 ? （1）上样前先检查凝胶床面是否平整，如果倾斜不平整，可用玻棒将床面搅浑，让凝胶自然下降，形成水平状态的床面。用毛细吸管小心吸去大部分清液，然后让液面自然下降，直至几乎露出床面。 （2）用吸管将样品非常小心地滴加到凝胶床面上，注意不要将床面凝胶冲起。加完后，再打开底端出口，使样品流至床表面。用少量洗脱液同样小心清洗表面1～2次，然后将洗脱液在柱内约加至4㎝高。 （3）连接恒压瓶、层析柱、部分收集器，让洗脱液恒压（50㎝水柱）洗脱，用部分收集器按每管3mL收集洗脱流出液，各收集管于280nm处检测A280值。 ? [结果与计算] 1、以管号（或洗脱液体积）为横坐标、相应管的A280为纵坐标，绘制洗脱曲线。 2、根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积Ve，然后以蛋白质分子量的对数值（logMr）为横坐标、Ve为纵坐标，作出分子量标准曲线。 3、样品完全按照标准曲线的条件操作，根据紫外检测获得的洗脱体积，从分子量标准曲线查出相应的分子量。 ?