初次诊断的特发性间质性肺炎患者外周血DcR含量的检测.docVIP

　目的 检测初次诊断的间质性肺炎(IIP)患者血清中DcR3水平的变化并探讨其临床价值。方法 采用双抗体夹心BASELISA法和RTPCR分别检测103例IIP患者和81例健康对照组血清中DcR3水平和外周血PBMC中DcR3基因相对表达水平。结果 IIP组血DcR3水平〔（3.825 2±1.421 8）ng/dl〕高于正常对照组〔(1.007 9±0.479 3 ng/dl)〕(P＜0.01)；IIP组患者PBMC中DcR3基因的相对表达水平（0.421±0.076）高于正常对照组（0.213±0.067 ）(P＜0.05）。结论 检测血清DcR3水平有助于诊断早期IIP。 【关键词】 间质性肺炎；DcR3 　　近年来的研究发现，多种疾病如否性肿瘤、自身免疫性疾病及移植排斥等均与DcR3具有相关性。目前对DcR3表达研究多采用Northern blot、Western blot和免疫组化等方法，对血清DcR3的定量检测少有报道。笔者利用本室合成的DcR3抗体和本室建立的双抗体夹心BASELISA方法对初次诊断的特发性间质性肺炎 (IIP)患者以及健康对照者的血清DcR3含量进行比较，观察血清DcR3水平与IIP的相关性，从而为IIP的诊断提供一个简捷方法，为IIP治疗提供可参考的途径。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 　　我院2007年9月至2008年8月住院的初次诊断（病程＜3个月）IIP的患者103例，其中男57例，女46例，年龄45～71岁，平均54.6岁，均符合2000年美国胸科学会(AST)和欧洲呼吸学会(ERS)共同提出的IIP临床诊断标准；健康对照81例，男性48例，女性33例，年龄42～68岁，平均53.3岁，为各项检查正常的体检人员。 　　1.2 主要试剂和仪器 　　十二烷基肌氨酸钠、DEPC购自Sigma 公司，Oligo d(T)、AMV 逆转录酶、RNA 酶抑制剂、Taq DNA 聚合酶、细胞分离液等购自Promega公司 。引物由上海生工生物工程公司合成并纯化。双抗体夹心BASELISA试剂盒为本研究室提供。高速低温离心机HERMLEZ383K (HERMLELABOTECHNIK，GERMANY)，凝胶电泳成像分析系统Tannon GIS1000( Tannon 有限公司，上海)，纯水系统MILIPORE(MILIPORE Com，USA)，深低温冰箱Formo (Formon Com，USA)，恒温水浴箱DK28D(上海医用恒温设备厂)，PCR 仪FeroTec (杭州PCR 仪有限公司) 。 　　1.3 方法 　　1.3.1 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC) 　　研究对象各取静脉血5 ml，肝素抗凝；加入含 5 ml淋巴细胞分离液的离心管中，离心2 000 r/min，20 min，可见血浆与分离液的界面上有一白膜层，此即所需的 PBMC。吸出细胞至另一试管用生理盐水洗 3 遍，离心 2 000 r/min，5 min，弃上清。 　　1.3.2 双抗体夹心BASELISA法检测血清中DcR3水平 　　取1.3.1步骤中所得血浆作为标本，双抗体夹心BASELISA 操作过程参照试剂盒说明，分别用 B10RAD550 型酶标仪测定450 nm的A值，绘制标准曲线，计算样品中 DcR3含量。 　　1.3.3 人PBMC总RNA的提取 　　在上述 PBMC标本中加入变性裂解液Trizol 1 ml 吹打使细胞充分溶解，置室温 5 min后加入氯仿200 μl，剧烈震荡15 s，室温5 min，4 ℃12 000 r/min离心15 min，取上清加入等体积的异丙醇，混匀后-20℃ 1 h，4℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入 75%乙醇1 ml，4℃ 7 500 r/min离心5 min，吸去乙醇自然干燥10～20 min，溶于10 μl DEPC水中。此即人外周血总 RNA。 　　1.3.4 逆转录合成cDNA 　　在上步得到的10 μl模板RNA中，加入1 μl DEPC水，1 μl引物Oligo d(T)，稍离心，100℃沸水1 min；加入2 μl dNTP，4 μl 5×buffer,2 μl AMV逆转录酶，稍离心，42℃水浴90 min；沸水3 min，灭活AMV，得到总cDNA。 　　1.3.5 聚合酶链反应PCR 扩增DcR3基因（214 bp）和βactin 基因(570 bp) 　　引物序列：DcR3 基因引物正义链为5′TCAATGGCCAGGCTCTTC3′，反义链为5′GCCTCTTGATGGAGATGTCC3′；βactin 基因引物正义链为5′TGACGGGGTCACC