淋巴细胞种类检测的方法和意义.docxVIP

检测CD4+T淋巴细胞数的标准方法是流式细胞术。流式细胞术(flow?cytometry，FCM)是目前公认的测定淋巴细胞百分比和CD4+T淋巴细胞绝对数目的金标准。它是一种对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。流式细胞仪是集合了激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。随着相关技术的迅速发展，流式细胞仪成为日益完善的细胞分析和分选的工具。几乎临床医学各学科都涉及流式细胞分析技术的应用，它已成为推动临床医学发展的重要手段之一。人们发现HIV病毒感染者由于CD4+T淋巴细胞的减少而逐渐发展成为获得性免疫功能缺陷症(AIDS)后，流式细胞术由一种研究性的工具迅速发展成为常规临床诊断不可或缺的技术。在HIV感染者疾病进程观察、抗HIV病毒治疗时机的确定及抗病毒药物疗效的监测中，CD4+T淋巴细胞百分比及绝对数目的变化对临床均有重要的意义。为提高对艾滋病等疾病的诊断和治疗效果，改善艾滋病患者特别是农村患者的生存质量，中国已先后从美国BD公司进口了110台流式细胞仪，目前已配备到全国25个省的疾控中心和医院，专门用于艾滋病患者CD4+T淋巴细胞计数。目前国内三级以上医院的临床实验室绝大多数已开展了流式细胞分析工作。淋巴细胞各亚群百分比的测定影响CD4+T淋巴细胞计数的因素有季节、昼夜差、某些并发症和皮质醇类药物等，而性别、成人年龄、紧张、生理性应激和妊娠对CD4细胞数虽有影响，但影响不大。由于CD4+T淋巴细胞百分数受变异影响较绝对计数小，故CD4+T淋巴细胞百分率有时比绝对数对临床更有意义。随着荧光素种类的丰富，可以同时对样本的多种淋巴细胞亚群和亚类进行测定(表10．4)。1．实验原理利用荧光技术，在不同的鼠抗人的抗体上标上荧光素，此荧光抗体就同人淋巴细胞表面的CD分子特异性地结合，然后用流式细胞仪检测，结合分析软件的自动分析即可得出各亚群细胞的百分比。2．主要实验设备及试剂低速离心机(可调速；可放置12mm×75mm小管的转子)，移液器及涡旋混合器，烧杯，量筒或移液管，可放置12mm×75mm小管的试管架。PBS溶液：O．22um滤膜过滤。蒸馏水：0．22um滤膜过滤。NaClO3：滤纸过滤，清洗时请用蒸馏水10%稀释次氯酸钠，现配现用。多聚甲醛：贮存液为4％多聚甲醛溶液，pH7.2～7.4，置于2～8℃保存。使用时，用PBS稀释为1％浓度，0.22／um滤膜过滤后使用，2～8℃保存可用一周。3．实验步骤1)取出流式试管进行编号。采抗凝血2～3ml(室温放置不超过6h)，颠倒混匀，分别取100ul全血加入每支试管中，不要碰到管壁。2)轻轻混匀，依次加入20ul双标(CD3／CD4、CD3／CD8、CCl45／CDl4、CD3／CDl9、CD3／CDl6+CD56等)或三标荧光抗体(CD3／CD4／CD8、CD3／CDl9／CD45等)及同型抗体(Isotype)对照(鼠IgG1/IgG2a)。混匀后室温避光保存20min。3)取出试管，每管加入10倍稀释的FACS?Lysing?Solution?2ml，轻轻混匀，避光10min。待管内液体透亮。然后1200r／min离心5min，弃去上清液。4)每管加入1ml的PBS，轻轻混匀，1200r／min离心5min，弃去上清液。然后加入0．3ml?PBS混匀，4℃避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入O．3ml?1％的多聚甲醛，放4℃冰箱保存，48h内上机检测。5)在检测之前，先启动。FACSComp软件，对仪器用CaliBRITE?Beads试剂进行校准调试：取试剂盒中的未标记试剂一滴加人第一支试管，加入鞘液1ml，混匀；取4种试剂(FITC、PE、PerCP、Unlabeled)各一滴加入第二支试管，加入鞘液2ml，混匀。然后进行仪器的校准。6)启动Simulset软件或Cellquest软件检测标本(图10．1为检测结果样图)。4．注惹事项1)弃掉试管中的上清液时，一定保证垂直倒掉。2)2～8℃保存，抗体试剂在保质期内稳定。过期试剂不能使用。3)抗体试剂不能冻存，保存期间或与细胞孵育时不能直接暴露于光线。试剂瓶应保持干燥。4)操作时如未按指定的孵育和离心次数或温度进行，容易发生错误。5)为了得到理想结果，血样应在静脉穿刺后6h内染色。6)任何试剂的外观改变，如沉淀、变色，都表明试剂已不稳定，这时试剂不能使用。抗体试剂虽含有叠氮钠保护剂，仍需注意微生物污染，以免导致错误结果。