脊髓损伤的基因治疗.docVIP

脊髓损伤的基因治疗 中华神经外科杂志 1998年第6期第14卷 综　述 作者：高立达 单位：610041　成都，华西医科大学第一临床学院神经外科研究室 　　长期以来，医学家一直在努力探索脊髓损伤后的机能恢复治疗，但成效甚少。晚近，经过多年的研究发现脊髓损伤后仍存在一定再生能力（1），脊髓损伤后之所以不能恢复功能，系因损伤局部微环境的影响，它包括：(1)缺乏促进轴索生长的神经营养因子(NGFs)；(2)缺乏支持和引导神经生长的雪旺氏细胞(SC)、基板、神经膜管、Bunger带和细胞外基质；(3)成熟后的少突胶质细胞、星形细胞表面存在特异性蛋白NI-250，均系与髓鞘相关的轴索生长抑制性物质；(4)脊髓损伤局部有胶质增生及瘢痕形成，阻碍神经纤维的再生和伸延；(5)其它影响神经再生的调控因素的匮乏如：生长相关蛋白(GAP-34)、及早反应基因(IEGs)、降钙素基因相关肽(cGRP)、CL-2及C-Jun等。因此脊髓损伤后功能恢复，必须具备两个基本条件，其一是有脊髓内源性神经纤维再生的基础，其二是提供一个能够促进神经纤维再生的微环境。换言之，前者就是在受损区需有尚存活的、并具有生长潜能的神经元，后者为能提供神经生长基因的受体细胞，以促神经纤维生长、延伸、连接及功能重建（2）。 　　一、促脊髓再生的神经营养因子(NTF) 　　NTFs是一类由神经元、神经支配的靶组织及胶质细胞产生的神经营养因子，是有促进中枢和外周神经系统细胞分化、生长和存活作用的活性蛋白，现已知有20余种，但其中在体内和离体情况下均能促进神经生长作用者，仅有神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经营养素-3(NT-3)、神经营养素-4／5(NT-4／5)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等数种。据Kdiatsos等(1990)报道，脊髓损伤后局部神经生长因子受体(NGFR)的表达显著增多。Oudega等(1996)将外源性NGF和CNTF注射到脊髓损伤区，获得神经轴索明显再生的效果（3）。有作者将高效的NTFs基因先转染给适当的受体细胞，然后再植入脊髓损伤区，使NTFs在体内继续表达，以促进脊髓神经纤维再生。Tuszyns-ki等(1994)曾将重组NGF病毒载体转染给成纤维细胞，然后植入鼠脊髓的损伤区，获得较多的感觉神经元轴索生长，并持续有NGF表达1年之久（4）。为了研究外源性NGF对脊髓再生的作用，Oudega和Hagg(1996)曾用外源性NGF加神经移植的方法研究脊髓损伤后轴索的再生，结果于2周内NGF组轴索生长长度超过对照组3mm（3）。 　　关于NTFs对脊髓损伤的再生修复机理及其发挥生物学效应的原理，目前虽未阐明，但经多年的研究，现已知NTFs有低亲合力受体(INGFR)和高亲合力受体(HNGFR)两类，前者是富含半胱氨酸的跨膜糖蛋白，后者为具有酪胺酸激酶活性的跨膜糖蛋白，二者均与NGF、NT-3及N-4／5有关，其中以HNGFR为甚。Brunell等(1990)用Northern斑点杂交法分析鼠胸脊髓损伤后的脊髓总RNA以确定NGFRmRNA含量，结果发现：伤后4天伤区脊髓NGFRmRNA含量明显升高，伤后7天达峰值，并且高于对照组6～7倍之多，甚至于伤后2～4周时仍高出4倍，说明脊髓损伤能诱导脊髓神经元表达NGFR。因而多数学者认为：注射NGF至脊髓损伤区可使之与受损脊髓神经元轴索的NGFR结合形成复合体，并能被逆行转运到神经元细胞体内，进一步发挥其促神经再生修复的生物效应。有作者认为NTF对脊髓损伤的再生修复作用，可能是先与神经元细胞膜、胞浆轴索上的受体特别是HNGFR产生高选择性的结合，继而调控神经细胞内相关的细胞因子及钙离子的重新分布，改善损伤区的微循环，使之适于脊髓神经的恢复而提高再生修复的机能（5）。除此之外，NGF尚有减少超氧化自由基对脂质膜的损害，有促蛋白磷酸化的作用和调节受损脊髓前角运动神经元的mRNA转录功能，有助于脊髓的修复。 　　为了向脊髓损伤区提供足够的、持久的神经营养因子，最佳的途径就是转基因。目前所应用的转基因技术，是以腺病毒为载体，先将外源性基因重组至病毒DNA，然后再转染受体细胞，最后植入受损脊髓中，使之不断提供目的基因，发挥治疗作用。据Montgoinery等(1996)报道，脊髓损伤后的再生与修复需要三个基本条件：(1)尚有存活的神经元以保证轴索再生所需要的结构和功能性物质；(2)轴索再生的长度必须达到受损区的远侧端；(3)轴索应对位连接至相应的靶组织，始能有功能的重建（6）。 　　二、受体细胞(SC) 　　能够携带NTFs基因的受体细胞有多种，除SC之外，还有成纤维细胞、肌母细胞（4）等，甚至有作者采用重组病毒载体直接感染载体细胞，而不通过受体细胞植入受损区域