水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶热稳定性的研究.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（８）：３４～３９ 水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶的 热稳定性研究 １ ２ ２ ２ ２ １ 王　丰 　周惠萍 　 孔宝华 　范静华 　陈海如 　刘进元 （１清华大学生物科学与技术系分子生物学实验室 教育部蛋白质科学重点实验室　北京　１０００８４） （２云南农业大学云南省植物病理重点实验室　昆明　６５０２０１） 摘要　谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶是唯一能够直接还原生物膜上脂类过氧化物的过氧化物酶。 利用圆二色光谱（ＣＤ）、内源荧光光谱和差示扫描量热仪（ＤＳＣ）研究了温度对谷胱甘肽磷脂氢过 氧化物酶（ＯｓＰＨＧＰｘ）活性及其构象变化的影响。在温度为２０～２７．５℃ 期间，随着温度的逐渐升 高，ＯｓＰＨＧＰｘ的活性逐渐上升，到２７．５℃ 时达到最大值；在 ２７．５～４５℃ 时，随着温度逐渐升高， 其活性迅速下降；当温度超过４５℃时，其活性完全丧失。在２０～４０℃，ＣＤ光谱、内源荧光光谱和 ＤＳＣ均没有发生明显变化，暗示ＯｓＰＨＧＰｘ的结构基本保持完整；在 ４０～５５℃，ＣＤ光谱显示该酶 二级结构发生去折叠；内源荧光光谱的变化暗示该酶三级结构发生去折叠。其中在４０～４５℃， ＤＳＣ显示该酶可能存在两个去折叠中间体。当温度超过 ５５℃ 时，整个酶的构象不再发生变化， 呈现去折叠状态。 关键词　谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶　热致去折叠　荧光光谱　ＣＤ光谱　差示扫描量热法 ＋ 中图分类号　Ｑ５５４６ 　　生物大分子发挥正常的生理功能需要机体提供合 脂氢过氧化物酶 （ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ 适的氧化还原环境［１］。对于生活在有氧环境的植物来 ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＰＨＧＰｘ）在漫长的进化过程中逐渐进化出 说，活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）对其的攻击是 来，目前它被认为是机体内唯一能够直接还原生物膜 持续且不可避免的。许多环境因素像紫外辐射、化学 ［４］ 上脂类过氧化物的抗氧化酶 。哺乳动物中的ＰＨＧＰｘ 试剂、高温、细胞因子、病虫害等都能诱发机体产生 在结构上属于硫氧还蛋白折叠家族，是一种含硒蛋白 ＲＯＳ。如果不得到有效控制，ＲＯＳ就会引起机体内蛋 质，能够利用谷胱甘肽为还原性底物来还原磷脂氢过 ［２］ 白质、核酸、膜磷脂等细胞成分的氧化损伤 。膜脂双 氧化物。在哺乳动物 ＰＨＧＰｘ的活性中心，硒原子以硒 分子层中的不饱和脂肪酸很容易受到羟基自由基和超 ［５］ 代半胱氨酸 （ＳｅＣｙｓ）的形式存在。Ｈｏｌｌａｎｄ等 首次在 氧阴离子自由基等活性氧分子的攻击而发生过氧化． 柑桔中发现了植物 ＰＨＧＰｘ的存在，其活性中心为 Ｃｙｓ 这是一种自发的非酶促自由基链式反应，生物膜的过 ［６］ 而非 ＳｅＣｙｓ ，该酶对磷脂氢过氧化物（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ 氧化反应一旦启动，在无抑制剂和抗氧化酶作用的情 ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ）的活性仅为天然猪心 ＰＨＧＰｘ的１／５００， 况下，就会立即转向链式反应，最终造成生物膜发生泄 与基因重组的猪心 ＰＨＧＰｘ（活性中心由ＳｅＣｙｓ突变为 ［３］ 漏直至细胞死