骨髓细胞染色体标本的制备.docVIP

实验室名称 项目 编号 制定日期 遗传室 骨髓细胞染色体标本的制备 ****** **年**月**日 【目的】 保证骨髓细胞染色体的成功制备。 【适用范围】 用于白血病的染色体检查。 【该SOP变动程序】 本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。 【步骤】 骨髓细胞直接法 1采集标本：用0.2％肝素浸润针筒，抽取0.2－1ml骨髓（视增生程度而异），注入Hank’s液20ml瓶内； 2加入有丝分裂阻断剂：立即加入长春花碱应用液0.05ml-0.1ml(1-2滴)，终浓度0.025－0.05ug/ml,或秋水仙胺（素）100ul,终浓度0.05ug/ml,置37℃温箱1小时； 3收获细胞：将含骨髓细胞的Hank’s液倒入离心管内，离心1000rpm×10分钟； 4低渗：弃上清液，向管底细胞团加入已预温至37℃的0.075M Kcl 6-8ml/管，轻轻打匀，置37℃温箱40分钟。 5预固定：加入1ml/管新鲜配置固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1），打匀，立即离心1000rmp×10分钟； 6第一次固定：弃上清液，向管底细胞团加入固定液约8ml/管，打匀后置室温内静置30分钟； 7按上法在重复固定两次，每次15分钟； 8三次固定后，离心1000rmp×10分钟，弃上清液，加入适量固定液，配成浓度合适的细胞悬液； 9制片：气干法加火焰烘烤； 10染色：10％Giemsa染20分钟左右，水洗、、℃冰箱保存数周到数月，随时可供各种显带处理。 我们目前采用生理盐水10ml代替Hank’s液，结果相同，而费用则更为节省。 骨髓细胞短期培养法 1无菌下抽取骨髓1－3ml后注入5 ml1640培养基内，带回实验室后在超净台中抽取20 ul骨髓细胞培养液，加入0.38ml白细胞稀释液中，进行有核细胞计数，按1－2×106/ml的细胞终浓度接种于1640培养基内，至于2份，置37℃温箱24－48小时。 以下步骤同直接法。 骨髓细胞同步化培养 1细胞按1－2×106/ml终浓度在1640培养基内预培养24小时后，加入FdU(终浓度3×10-7M)和Ud(终浓度2 ug/ml)37℃温箱内置17小时； 2在加入BrdU(终浓度30 ug/ml)37℃温箱小时，之后加入秋水仙胺（终浓度0.05 ug/ml）37℃15分钟 以下各步骤与直接法相同。 当骨髓细胞染色体分析发现100％的细胞均为异常核型时，则有必要进一步加做外周血＋PHA的培养，以除外体质性染色体异常。 直接法 培养法 同步法 PB+PHA 优点 简单、方便 异常检出率高 异常检出率高,且带纹精细，有助于确定断裂点、识别微小畸变和进行基因定位 除外体质性畸变 缺点 质量稍差，异常检出率低 培养结果受温度。培养液PH，小牛血清效价等多种因素影响 费时多、成本高、手续烦、不适合常规使用 对检出白血病核型异常无帮助 适应症 CGL、ALL、MDS ANLL、MDS、CGL-Bc ANLL、MDS、 CGL-Bc 骨髓细胞异常核型为100％时 操作人员 部门主管 质量负责人 姓名 吴芬 ****** ****** 日期 04年07月23日