高效液相色谱法测定发酵液中利巴韦林含量.docVIP

高效液相色谱法测定发酵液中利巴韦林含量实验目的：通过运用高效液相色谱仪（igh Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定发酵液中利巴韦林含量，熟练掌握HPLC。实验方法：高效液相色谱法，采用C18反相色谱柱，流动相为4%乙腈和96%水，流速1ml/min，检测波长207nm，柱温18.5℃，自动进样器进样量5(L。实验原理：利巴韦林为广谱抗病毒药物，对DNA和RNA病毒均起抑制作用，在207nm下有最大吸收峰； 色谱法的分离原理是溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，又称为色层法、层析法。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱反相色谱法：一般用非极性固定相（如C18、C8），流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。仪器与试剂：高效液相色谱仪；色谱柱：SinceHome C18，5 (m，250×4.6 mm，P/NS/N：902200；保护柱；乙腈（色谱级）；纯净水；利巴韦林（纯品）；0.22(m滤膜若干；0.45(m水系膜和有机膜若干实验步骤： 1 实验准备 1.1 用纯净水配制不同浓度（0.02,0.04,0.08,0.16,0.24,0.48g/L）的利巴韦林标样；将利巴韦林发酵液12000rpm离心5min，用纯净水稀释50倍； 1.2用0.22(m滤膜将不同浓度的利巴韦林标样和稀释的发酵液过滤，分别装入不同的进样瓶； 1.3 分别用0.45(m水系膜和有机膜过滤乙腈和纯净水，将过滤好的乙腈和水分别装入高效液相色谱仪（液E）的C瓶和A瓶； 1.4 安方向分别安装保护柱和色谱柱； 1.5 向高效液相色谱仪插入计费卡，开启高效液相色谱仪和计算机；设置相关信息（如水和乙腈的实际体积，最高柱压，操作者，存储目录等）； 1.6 分别对水和乙腈进行在线脱气（旋钮旋松，流速3ml/min,时间约3~5min）； 1.7 降低流速至1.2ml/min，旋紧旋钮，用乙腈冲洗色谱柱至极限平，设置实验方法，流动相冲平极限； 2 制定标准曲线 2.1 将StopTime设置为5min，并保存“方法”； 2.2 编写并运行S Table； 2.3 以利巴韦林浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程： Y=KX 式中 Y：峰面积X：标准品浓度 3 发酵液中利巴韦林含量的测定 3.1将StopTime设置为12min，并保存“方法”； 3.2编写并运行S Table； 3.3 根据检测结果和标准曲线计算发酵液中利巴韦林的含量， 式中X：利巴韦林浓度（g/L）；A：样品的峰面积； K ：回归方程所得值；稀释倍数：50 4实验结果与分析： 4.190 DAD1 A, Sig=207,4 Ref=360,100 (XJG4171 2010-04-22 16-25-42\015-0501.D) 400 300 200 100 0 mAU 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 min