能源甘蔗汁高温酒精发酵酵母菌种选育.pdf

摘要 摘要 本文以甘蔗糖蜜酒精生产菌种酿酒酵母(Saccharomyces 温的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromys 融合技术进行属间杂交，选育适合于能源甘蔗汁高温发酵高产酒精的酵母菌种。主 要研究内容如下： 1．全面考察了融合亲株的生理特性及酒精发酵特性。酿酒酵母Y01和马克斯 克鲁维酵母Y05都能发酵甘蔗汁产生酒精。Y01最适生长温度为30℃，最适发酵温 度为34C，温度升高对其酒精发酵影响不大。 2．确定了酿酒酵母Y01和马克斯克鲁维酵母Y05原生质体制备与再生的最佳 都采用4％NaCl，稀释和配制再生培养基采用15％蔗糖。 汁中，以6％的接种量接种，40℃发酵72h，产酒率可达副9．79％。经过十次传代后， 其遗传性能稳定。 4．采用紫外诱变及TTC鉴别培养基，筛选到4株马克斯克鲁维酵母Y05呼吸 缺陷型突变株，比较了呼吸缺陷型突变株与野生菌株的产酒精能力。 关键词酵母菌；高温酒精发酵：原生质体融合；呼吸缺陷型 中文文摘 中文文摘 随着我国经济的快速发展，石油供需矛盾日益加剧。加快燃料酒精产业的发展 步伐是解决我国能源短缺问题的重大举措。利用能源甘蔗生产燃料酒精在我国具有 广阔的发展前景。我国甘蔗产区地处亚热带，环境平均温度较高，传统工业生产上 使用的酵母菌种适用于玉米、小麦、糖蜜等原料的酒精发酵，酵母的耐温度性较低， 发酵过程受到温度的影响，导致酒精发酵效率酶降低。要实现低成本、高产率大规 模生产这个目标，选育耐高温的酵母菌种是能源甘蔗汁发酵生产燃料酒精的关键技 术之一。 最近的研究表明，酵母菌耐高温和高产酒精性状是由多个基因控制。原生质体 融合技术具有杂交频率高，进行杂交所受限制小，可以实现多基因重组等优点，已 经成为工业微生物育种的重要手段，并取得了较大成就。本文以甘蔗糖蜜酒精生产 菌种酿酒酵母和耐高温马克斯克鲁维酵母为亲本，采用原生质体融合技术选育适合 于能源甘蔗汁高温发酵高产酒精的酵母菌种■一取得以下研究结果i 1．以能源甘蔗汁作为培养基，研究了出发菌株的生理特性及酒精发酵特性。实 验结果表明：酿酒酵母Y01能够发酵甘蔗汁产生酒精，蔗糖酶活性为237．84 oBx的糖浓度，在30C培养条 lamoL／min．mL，能耐受14％(v／v)的酒精浓度和35 件下，可获得最高生物量，对数生长期大约处在2—12h之间，代时为1．8h。温度对 醪液的酒精含量呈现先升高后下降趋势。以180Bx的能源甘蔗汁，32℃发酵72h， 最适生长温度为37℃，最适发酵温度为34℃，温度升高对其酒精发酵影响不大。 2．原生质体的制备与再生是原生质体融合的前提，酵母菌原生质体融合技术， 存在的主要技术难题是原生质体制备率较高，再生率较低，甚至接近于零。本文主 要研究了预处理、稳渗剂、菌龄、酶浓度、酶解时间等5个因素对融合亲株原生质 体制备率与再生率的影响。确定原生质体制备与再生的最佳条件为：酿酒酵母Y01 制酶解液时稳渗剂采用4％的NaCl，稀释和配制再生培养基采用15％的蔗糖，其原 IV 中文文摘 液时稳渗剂采用4％的NaCl，稀释和配制再生培养基采用15％的蔗糖，其原生质体 形成率为94．8％,--,99．704，再生率为32．5％39．8％。 3．遗传标记的选择直接影响原生质体融合子的筛选效率，本文采用融合双亲本 在42℃培养条件下的菌落形态差异和热灭活Y05原生质体为遗传标记，从再生平板 上检出103株融合子。初筛采用杜氏发酵管在40C条件下发酵，筛选耗糖速率比较 多者作为复筛菌株，复筛采用发酵栓在40C条件下发酵72h，筛选产酒率最高，发 酵第一天C02减重最多者。经过视筛和复筛，从103株融合子中筛选到1株在40C 酒率提高了14％。融70的细胞体积和菌落形态都不同于双亲本。经过十次传代后， 其遗传性能稳定。对融70的酒精发酵条件进行了初步的优化，融70在160Bx的能 源甘蔗汁培养基中，接种量为6％，40℃发酵72h，发酵醪液的酒精可达9．79％。 4．据文献报道，某