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邻苯二甲酸酐修饰漆酶应用于降解蒽的研究 1 1 1 1 1 2 1 2 1 花秀夫 ，戈钧 ，李苏 ，张坤 ，徐圆圆 ，王君 ，刘永民 ，刘铮 1. 清华大学化学工程系生物化工研究所，北京（100084 ） 2. 辽宁石油化工大学，辽宁抚顺（113001 ） E-mail ：liuzheng@ 摘 要：本文采用邻苯二甲酸酐对漆酶进行化学修饰，考察修饰酶的稳定性及其降解多环芳 烃蒽的反应特性。采用三硝基苯磺酸(TNBS)显色法测得漆酶的氨基修饰度为63.8%；以2,2’- 连氮-双(3- 乙基苯并噻唑-6-磺酸) (ABTS)为底物测定修饰漆酶的催化特性，修饰漆酶较天然 漆酶具有更好的底物亲和性，其55°C 下的酶活半衰期从192.5 min 延长至532.4 min ，其耐 酸性也显著提高。圆二色性光谱和荧光光谱的表征结果显示修饰酶与天然漆酶具有相同的二 级和三级结构；在30°C 下，经过72 h 反应，修饰漆酶对蒽(anthracene)的降解率达到36%， 较天然漆酶提高了近2 倍。 关键词：生物化工；蒽的降解；化学修饰；漆酶 中图分类号：O629.73; O643.1 文献标识码：A 价值。 0. 引言 1. 材料与方法 多环芳烃的降解是环境保护领域的重 要课题[1,2] 。目前生物法降解多环芳烃研究主 1.1 试剂 要集中于白腐真菌[3,4] ，其有效性已经得到确 漆酶（源自白腐菌Trametes versicolor, 认。但该菌生长相对缓慢，降解速率亦不够 Sigma 公司产品）；2,2’-连氮-双（3-乙基苯 高，为提高环境修复的速率，以该菌中主要 并噻唑-6-磺酸）（ABTS ，Sigma 公司产品）； 降解酶-漆酶为主构建酶反应器是一种值得 蒽（PAHs ，Sigma 公司产品）邻苯二甲酸 探索的策略[5,6] 。 酐(phthalic anhydride) （广州化学试剂公司产 漆酶(Laccase，EC) 是一种含铜 品，分析纯）；除特殊说明，本文所采用的 的多酚氧化酶，属蓝色多铜氧化酶(blue 试剂均为分析纯。 multicopper oxidase)家族。漆酶能氧化酚类 和芳香类化合物,同时伴随电子的转移，将分 1.2 酶活检测 子氧还原成水[7] 。漆酶在液体环境中能够氧 以 2,2’-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺 化有毒有机物[8~10] 。 酸）（2,2’-azino-bis- (3-ethylbenzothiazo line 天然漆酶在作用过程中易受环境条件 -6-sulfonic acid)，简称ABTS ）为底物。向 影响而变性失活，限制了其工业化应用 930 µL 0.01mol/L、pH5.0 醋酸缓冲溶液中加 [11,12]，目前提高漆酶稳定性的研究主要集中 入50 µL 适当稀释的酶液后，再加入20 µL 于开发新的化学修饰方法[13] 。 50 mmol/L ABTS 溶液，混合后立即在室温 本文采用邻苯二甲酸酐对漆酶进行了 下测定反应的前2 min 内反应液在420 nm 化学修饰，以蒽为模式底物，研究修饰漆酶