使用圆二色性光谱和红外光谱的研究冬小麦麸皮抗冻蛋白二级结构.pdfVIP

使用圆二色性光谱和红外光谱研究冬小麦麸皮抗冻 蛋白的二级结构1 1,2 2* 1 1 2 张超 ，张晖 ，赵晓燕 ，马越 ，姚惠源 1. 国家蔬菜工程技术研究中心，北京市农林科学院，北京（100097 ） 2. 江南大学，食品科学与工程国家重点实验室，无锡（214122 ） 摘 要：使用圆二色性光谱和红外光谱技术对冬小麦麸皮抗冻蛋白的二级结构进行研究。 由于冬小麦麸皮抗冻蛋白在酰胺I 带和III 带位置中，各个特征峰相互叠加，因此采用Gausse 峰型对圆头峰进行拟合，解析，判断其α-helix ，β-sheet ，β-turn 和random coil 的相对含量。 并讨论了两种检测方法结果差异的原因，为冬小麦麸皮抗冻蛋白抗冻机理的研究奠定基础。 关键词：冬小麦麸皮抗冻蛋白 二级结构 红外光谱 圆二色性光谱 酰胺I 带和III 带 抗冻蛋白是一种具有降低体系冰点、抑制体系发生重结晶作用的蛋白质，其独特的特性 是与其结构密不可分的[1] 。在前文的研究中，本课题组从冬小麦中筛选获得抗冻蛋白 TaAFP[2]，但是对其结构和抗冻机理还知之甚少。为了进一步研究TaAFP 的抗冻机理，本文 对TaAFP 的二级结构进行研究，通过对TaAFP 二级结构的解析，可以为从理论上解释TaAFP 与冰晶结合的方式与结合位点奠定基础，有效地揭示TaAFP 的抗冻机理。 光谱技术是研究生物蛋白质构象与功能关系的一种有效途径，其中圆二色光谱（CD ） 可以灵敏地反映出蛋白质构象的变化，已被广泛应用于蛋白质的构象研究中[3, 4] 。傅立叶变 化红外光谱（FT-IR ）属于振动光谱，主要研究分子间能级的跃迁，是依据被检测样品中某 一化学成分在近红外光谱区的吸收特性不同而进行定量检测的一种无损、非破坏的绿色分析 方法[5, 6] 。通过测定样品酰胺I 带和III 带构象中α-helix，β-sheet，β-turn 和random coil 的相 对含量，最终获得样品的二级结构信息[5, 7-9] 。本文结合使用CD 和FT-IR 光谱的两种测定方 法，最终确定了TaAFP 的二级结构信息。 1. 材料与方法 1.1 TaAFP 的分离纯化 [2] TaAFP 按照本课题组已报道的方法纯化 。 1.2 圆二色光谱检测 将样品溶解于ddH O，蛋白浓度达到0.1 mg/mL，测定远紫外区（190-250 nm）CD 谱。 2 采用光径0.1 cm，分辨率为0.2 nm，谱带宽度为 1.0 nm，灵敏度为20 mdeg ，响应时间为0.25 o sec，扫描速度为100 nm/min，环境温度25 C，重复扫描8 次，累加得到CD 谱图。 图谱经过仪器本底消除和溶液空白差减，然后用根据 Chen-Yang 原理[10]和最小二乘法 编写[11] 的程序计算α-helix、β-sheet 和random coil 的百分比含量。 1.3 FT-IR 光谱检测 将冻干样品置于干燥器内用P O 充分干燥，称取样品1 mg，与100 mg 溴化钾研磨混 2 5 匀压片测定FT-IR 。在数据采集期间，为了减少水蒸汽IR 吸收的干扰，持续用干燥的N2 淋 洗测量室。在与样品测定完全相同的条件下在室温敞开状态收集空气背景。测定在波数 1本课题得到国家十五攻关项目（No.2001BA501A03 ）的资助。 - 1 - 4000-400 cm-1 的吸收光谱，分辨率4 cm-1 ，波数精度0.01 cm-1 ，扫描次数32 次，环境温度