伪狂犬病病毒gE基因的原核表达及间接ELISA方法的建立.pdfVIP

动物医学进展。2009，30(7)：38—42 ProgressinVeterinaryM edicine 伪狂犬病病毒 gE基因的原核表达及 间接 ELISA方法的建立 王云龙 ，王国强。，李智涛 ，朱永喜 ，李玉林 (1．郑州职业技术学院．河南郑州 450121；2．河南省生物工程技术研究0e心 ，河南郑州 450001) 摘 要：以质粒 pBV222／gE为模板 ，经PCR扩增 出750bp的伪狂犬病病毒 (PRV)gE基 因片段 ，克隆 入 pET一4lb质粒中并转化大肠埃希茵TG 。经PCR、酶切鉴定，筛选 出阳性重组质粒 pET4lb／gE后 ，转化 表达茵Balgold，IPTG诱导，目的蛋 白经镍柱亲和层析纯化，SDS—PAGE凝胶 电泳和 Westernblot分析检 测。以纯化后的目的蛋 白作包被原 ，建立间接 gE—ELISA检测方法。结果表 明，目的基 因在 3O。C，0．025 mmol／LIPTG诱导条件下，可在 Balgold中高效表达，目的蛋白大部分以可溶性形式存在，并能被 PRV阳 性血清所识别，方阵滴定法确定了间接 ELISA方法的抗血清最佳稀释度 (8O0倍)和包被抗原的最佳工作浓 度 (1rag／L)。 关键词：伪狂犬病毒 ；gE基 因；原核表达 中图分类号：$852．659．1；Q786 文献标识码 ：A 文章编号：1007—5038(2009)07—0038—05 伪狂犬病 (Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病 1 材料与方法 毒 (Pseudorabiesvirus，PRV)引起的多种家畜、野生 1．1 材料 动物的一种 以发热、脑脊髓炎为主症 的急性传染 克隆菌 TG 、表达菌 Balgold、质粒 pBV222／gE 病[1]。猪是本病的主要宿主和带毒者。通常引起妊 及表达载体 pET一4lb由河南省生物工程技术研究 娠母猪流产、木乃伊胎 、死胎和产弱仔 ；初生仔猪 出 中心提供。 现神经症状 ，感染率和病死率可达 100 ，成年猪感 限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶 、T4DNA连 染后多耐过，不发病但呈隐性感染 ，造成长期带毒排 毒，成为最危险的传染源。该病对世界畜牧业产生 接酶 ，无 DNA酶的胰 RNA酶为宝生物工程 (大连) 了极大的危害，已成为世界各国检疫和 防疫的重点 有限公司产品；pfuDNA聚合酶购 自天为时代公 对象 引。 司；DNA快速 回收试剂购 自QIA GenSciences公 在 目前已鉴定 的PRV l1种糖蛋 白中，gE是其 司。 中一种十分重要 的非必需糖 蛋 白。PRV gE是 由 设计一对扩增 PRV gE基 因的引物，由上海生 588个氨基酸组成 的表面蛋白，它决定 了病毒的毒 工生物工程技术服务有限公司合成。 力，但不是病毒复制必需蛋 白。当 gE基因被删 除 上游 引物 ：5-CG GGATCCCGTCACCGAG— 后，病毒的复制扩增及抗原性并不受影响，但它的毒 GTCCCGAGTCC一3(引入 BamHI位点) 力却大大降低[3]。另一方面，gE几乎存在于所有的 下 游 引 物 ：5-CG GAATTCCACGCG CG— 已知的PRV分离株 中，且 自然感染常导致产生 gE GCATCAGGTCGAA一3(引入 EcoRI位点) 的抗体 ]。这些特征都使伪狂犬病非常适合于血清