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中国农业科学院蛋白质 组学与分析技术课程论文 论文题目:蛋白质组学分析技术在研究棉铃虫Bt抗性中的应用 课程名称: 蛋白质组学与分析技术 学 期： 2013-2014学年度第一学期 班 级: 13级硕士8班 学 号: 82101132313 姓 名: 袁 向 东 2014年4月目录 一、Bt结构和功能 2 二、Bt毒素的作用机制 3 2.1穿孔假设模型： 3 2.2 信号转导假设模型 4 2.3 渗透溶解和信号转导共同作用假设模型 4 三、运用蛋白质组学分析技术研究棉铃虫对Bt蛋白产生抗性的原因 5 3.1材料与方法 6 3.1.1抗性品系筛选 6 3.1.2棉铃虫中肠总蛋白的制备 6 3.1.3双向电泳分离蛋白 6 3.1.4分析敏感棉铃虫和抗性棉铃虫中肠上调和下调蛋白 6 3.1.5蛋白质显著性富集分析，归纳中肠上皮细胞同类受体的表达情况 7 3.1.6 Western Blot分析验证 7 3.1.7分析与之其反应的蛋白点 7 3.2分析抗性产生的原因 7 3.2.1确定Cry1Ac与受体是否结合 7 3.2.2受体蛋白的表达量下调 7 3.2.3结合位点的改变 8 3.2.3凝胶蛋白阻滞 8 3.2.4观察受体与蛋白结晶的结合部位 8 致谢 10 蛋白质组学分析技术在研究棉铃虫Bt抗性中的应用 摘要：目前棉苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前产量最大、使用最广的生物杀虫剂。它的主要活性成分是在其形成芽孢的过程中产生的具有杀虫活性的伴孢晶体，又称杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)或δ-内毒素，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫，以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物都有特异性的毒杀活性，同时对害虫天敌和高等动物无毒性，世界上应用最为广泛、用量最大、效果最好的微生物杀虫剂。 苏云金芽孢杆菌由日本细菌学家石渡和德国科学家恩斯特·贝尔林纳（Ernst Berliner）分别在1901年和1911年独立发现。贝尔林纳是从患有叫Schlaffsucht的疾病的地中海粉蛾幼虫中发现该菌，并用发现地德国图林根命名。苏云金芽孢杆菌的应用始于欧洲的一个实验室，人们利用小型发酵装置生产出Bt芽孢和晶体混合物，目的是用于防治欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)。1981年，Schnepf和Whiteley首次从库斯塔克亚种（Bt subs.kurstaki）HD-1菌株中成功的克隆出第一个编码Bt杀虫蛋白的基因，并将其转入大肠杆菌Escherichia coli（E.Coli）中表达，发现表达后的杀虫晶体蛋白对烟草天蛾Manduca sexta幼虫具有很高的毒杀作用。1988年Monsanto公司将外源Bt杀虫晶体蛋白导入棉花，并获得良好的抗虫性。1998年，在无脊椎病理学会年会上成立的由Crickmore为委员的委员会更新了Cry内毒素的命名法，新的命名法以杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性为唯一标准，将杀虫晶体蛋白分成四个等级：杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性小于45%定为第一等级，即Cry1和Cry2之间，用阿拉伯数字表示；同源性在45%-78%之间定为第二等级，即Cry1A和Cry1B之间，用大写英文字母表示；同源性在78%-95%之间定为第三等级，即Cry1Aa和Cry1Ab之间，用小写英文字母表示；同源性在95%以上定为第四等级，即Cry1Aa1和Cry1Aa2之间，用阿拉伯数字表示。，Cry毒素的3D结构已经弄清楚，：Cry1Aa，Cry1Ac，Cry2Aa，Cry3Aa，Cry3Ba，Cry3Bb，Cry4Aa，Cry4BaCry8Ea。 Bt 毒素一般含有三个结构域：结构域Ⅰ(domainⅠ，DⅠ)、结构域Ⅱ(domainⅡ，DⅡ)、结构域Ⅲ(domainⅢ，DⅢ)，每一个结构域的生物学功能不同。其中，Ⅰ有七个α螺旋缠绕而成，在膜的插入，毒素寡聚化和孔洞形成中有重要的作用。结构域Ⅱ是三个反平行的β-折叠片层呈β-三棱柱（beta-prism）围成一个疏水核心，与受体识别有关。结构域Ⅲ是两个反向平行的β-折叠组成的β-三明治(β-sandwich）夹心结构。结构域Ⅱ和Ⅲ通过在不同的昆虫中肠蛋白中调节特异的互作具有重要的作用。第三个空间结构是保守的，说明Cry-3D家族具有相似的作用机制机制，即使它们的氨基酸