脐血CD44^＋细胞成骨转化的研究.pdfVIP

山东医药2010年第5O卷第 1期 脐血 CD44+细胞成骨转化的研究 罗 美 。马云胜 ，纪小龙 (1辽宁医学院生物化学教研室，辽宁锦州121001；2辽宁医学院组织胚胎学教研室； 3北京市武警总院) 摘要：目的 从人脐血中分离可以作为骨组织工程的种子细胞。方法 采用免疫磁珠法应用干细胞分离系统 分离出脐血CD44细胞，细胞贴壁后取P2代细胞进行成骨诱导。观察细胞形态学特征、生长情况，流式细胞仪检 测细胞周期及表型。诱导后碱性磷酸酶染色和Von—Kossa染色法检测成骨能力。结果 贴壁细胞形态呈长梭形 ， 需3周长满瓶底 ，传代后细胞增殖速度增快，细胞表型为CD44 。诱导细胞增殖速度均明显减慢。碱性磷酸酶染 色细胞阳性率为66．O％。Von．Kossa染色提示细胞成骨诱导后有钙化结节形成。结论 脐血CD44’细胞可以向成 骨细胞分化。 关键词：脐血；成骨诱导；CD44 中图分类号：R324．28 文献标志码：B 文章编号：1002-266X(2010)01-0063-02 近年文献报道，脐血中可以分离出少量的类似 L—DMEM培养基进行成骨诱导 J。常规换液，连续 于骨髓基质细胞 (BMSCs)的细胞 J。由于这些细 培养21～30d。 胞具有原始、免疫原性小、异体移植排斥反应小、取 1．4 碱性磷酸酶染色 成骨诱导后7—14d后，去 材方便、来源广泛等一系列优点，有望成为组织工程 除培养液，PBS漂洗，以4％多聚甲醛固定 30min， 新型 的种子 细胞。由于该细胞大部分表现 为 蒸馏水洗2遍，然后按碱性磷酸酶试剂盒说明书操 CD44 ，故本文采用改良的特殊分离法分离培养脐 作规程进行染色，镜下观察细胞显色情况，以细胞质 血CD44 细胞，检测其成骨能力，为骨组织工程提 染成蓝色为阳性结果。 供一个种子细胞来源。 1．5 Von—kossa染色 将成骨诱导2l～30d的细胞 1 材料与方法 取出，PBS清洗 2次，4g／L多聚甲醛固定 30min 1．1 细胞分离与培养 采集健康正常新生儿脐带 后，2％硝酸银于暗处染色 1h，蒸馏水洗 ，5％硫代硫 血 10份，每份 7O～110ml。利用淋巴细胞分离液分 酸钠还原1h，镜下观察并拍照。 离单个核细胞后采用免疫磁珠分离系统收集 2 结果 CD44 细胞 。用 L—DMEM培养液悬浮上述制备好 2．1 细胞形态学特征 培养 48h后，镜下可见散 的细胞，按 1×10 rnl密度接种于培养瓶 中，于 在的单个贴壁细胞出现，贴壁细胞 以长梭形细胞为 37oC、5％CO、饱和湿度 CO 孵箱中培养。3d后 主 ，细胞边界折光性强。贴壁细胞增殖迅速 ，细胞呈 换液，以后每4～5d半量换液 1次。待细胞融合后 克隆样生长，第 5天时形成 2O一50个细胞集落，并 以0．25％胰蛋白酶-0．02％EDTA液消化，以1×10。 维持成纤维细胞样形态，以后细胞数量继续增加，3 爪／ml密度接种，进行传代。 周时融合。细胞传代后增殖加快，7～10d融合。 1．2 细胞形态学观察与细胞周期检测 每 日于倒置 2．2 细胞周期 流式细胞仪检测贴壁细胞处于 显微镜下观察细胞形态与增殖情况，采用标记5个细 Go／G。期的细胞多，为 (86．54±2．31)％，S期为 胞生长良好的位置并计数。取P2代细胞，0．25％胰 (4．23±0．36)％，G2／M期为(9．23±O．73)％。 酶-()．02EDTA消化制成单细胞悬液，细胞数量不少 2．3 成骨能力 在成骨诱导培养基中，细胞增殖明 于 1×10 个，乙醇固定 30min，PBS清洗后离心，1 显比对照组缓慢，细胞基本维持原有的形状。未加 诱导剂的对照组细胞增殖较