石蜡包埋组织中DNA甲基化特异性PCR技术.pdfVIP

第 28卷第 18期 第 三 军 医 大 学 学 报 Vo1．28，No．18 2006年 9月 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE Sep．2006 1915 文章编号：1ooo-5404(2006)18-1915-03 技术方法 石蜡包埋组织中DNA 甲基化特异性 PCR技术 高丽莉，胡义德，刘洪旗 (第三军医大学新桥医院肿瘤科，全军肿瘤诊治中心，重庆市肿瘤生物技术研究所，重庆400037) 提 要：目的 以石蜡包埋组织提取的 DNA为模板进行 DNA甲基化特异性 PCR(MSP)检测，研 究其可行性。 方法 35例石蜡包埋肺癌组织DNA样品制备和亚硫酸氢盐修饰后进行MSP扩增检测。结果 石蜡包埋组织 MSP检出 率与文献采用新鲜组织标本报道一致。结论 MSP通过选择合适的实验条件，可适用于石蜡包埋组织 DNA甲基化分析。 近年来有关 DNA 甲基化与肿瘤发生的关系 日益 1．4 引物 受到人们的重视 ，成为肿瘤分子生物学研究热点之一。 INK4a／ARF基因引物设计参考文献 [1，2]，由上海博亚公 研究表明．肿瘤抑制基因的CpG序列易发生 甲基化， 司合成。见表 1。 其高度 甲基化可能与基因的失活和肿瘤 的发生有关。 表 1 INK4a／ARF基因的MSP引物 对于DNA 甲基化的检测现在多采用 甲基化特异性 PCR(methylation—specificPCR，MSP)，其基本原理是 通过亚硫酸氢盐对 DNA样 品的修饰，非甲基化的胞嘧 啶发生脱氨基反应而成为尿嘧啶，而发生 甲基化 的胞 嘧啶却不能发生脱氨基反应 ，碱基不发生转变。再运 用甲基化特异性引物和非 甲基化特异性 引物进行 W：野生型 ；m：甲基化 ；u：未甲基化 PCR扩增 ，从而对 DNA的甲基化状态予以检测。以往 实验多采用新鲜组织，使研究样本来源受到很大的局 1．5 方 法 限，而本实验是 以石蜡包埋组织为材料 ，对 INK4a／ 1．5．1 从经 甲醛固定、石蜡包埋组织中提取 DNA 将石蜡 ARF基因启动子区的甲基化情况进行MSP检测，取得 包埋的组织块切成 10 m厚，取7～8片放人 1．5mlEp管中， 每管加 1．0ml二 甲苯振摇 30min，10000 g离心5min，去上 了初步的经验和较好的效果 。 清，沉淀用二 甲苯重复洗 1次，加 1．0ml无水乙醇，轻轻翻转 1 材料与方法 混匀3min，10000×g离心5min，去上清，加无水乙醇再洗 1 次，沉淀在室温中干燥。 1．1 标本采集 每管加 TE0．5ml，20％SDS25txl及蛋 白酶K(20mr／m1) 35例非小细胞肺癌 (non—smallcelllungcancer，NSCLC)石 5txl，混匀。55℃水 浴 24h，等体 积饱 和酚／氯仿 ／异戊醇 蜡标本 由新桥医院病理科提供。 (25：24：1)抽提 2次，加入 1／10体积 3mol／L醋酸钠，2．5倍体 1．2 主要 试 剂 积冷无水 乙醇，混匀 ，一20℃至少放置 30min，12000×g离心 EZDNAMethylationKit为Zymo公司产品，SssI甲基转移 20min。收集沉淀。75％乙醇洗沉淀物 2次，室温晾干。加入 酶为NEB公司产品，