医用PU_聚氨酯_脱细胞软骨支架的研制与性能分析_.pdfVIP

材 料 与 方 法 1.材料和方法 1.1. 主要材料、试剂及仪器: 猪膝关节软骨(太原市屠宰场) 磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.40，自己配制并消毒) D-Hank ’s 液（实验室自行配制） Triton X-100 ，Tris-HCL 液( pH 7. 4), 苯甲基黄酰氟（PMSF ，蛋白酶抑制剂，浓度 0.35ml/L ），（购自Sigma 公司） DNase 酶，RNase 酶，（购自Sigma 公司） 摇床（北京博医康技术公司） 医用聚氨酯(PU) ( 山东济南岱罡生物科技有限公司) 氯化钾(哈尔滨化学化工制剂厂) 1,4 一二氧六环溶剂(天津外环化工有限公司) MIAS-2000 型图像分析系统( 四川川大智胜软件股份有限公司) FD-1 真空冷冻干燥机（北京博医康技术公司） Instron 5544 型材料性能测试机(北京英斯特朗公司) 1.2. 实验分组： 根据 PU 与脱细胞软骨基质的构成比进行实验分组，即不加入脱细胞软骨基质组为对 照组(PU 组) ，构成比为2:1 组为实验 1 组(2:1 组) ，构成比为4:1 组为实验 2 组(4:1 组) 。每 组又按 3 种不同的实验温度(0℃，-10℃，-20℃)分为 3 组。各组样本量均为 30 份。 1.3. 脱细胞软骨基质的制备 1 取新鲜猪关节软骨制备成 3.5mm*3.5mm, 厚度 0.2-2.0mm 的小块，然后将其放入加 注庆大霉素的生理盐水中，以防止感染的发生，之后再用生理盐水冲洗三遍，用磷酸盐缓 冲液漂洗三遍。 2 将关节软骨组织块放入含有蛋白酶阻断剂（苯甲基黄酰氟 0.35ml/L ）的Tris -HCl(pH 7.4)缓冲液中, 置于摇床 4 ℃持续震荡24 h 。 3 在 1%的 Triton X-100 的Tris –Hcl （v/v ）缓冲液内加入蛋白酶抑制剂-- 苯甲基黄酰 4 氟,将上步反应后的软骨组织块放入其中， 置于摇床上 4 ℃，200 转持续振荡 48 h ，标本 以双蒸馏水超声波连续冲洗24 h 。 4 将组织块置于 DNase 酶和 RNase 酶混合液（含有 ca 离子和 mg 离子，ph7.4 ）中, 37 ℃消化 12 h。 5 再次将组织块置于 1%的Triton X-100 的Tris –Hcl(v/v)缓冲液中, 4 ℃洗脱24 h 。 6 标本以双蒸馏水连续冲洗 24 h ，之后再以D-Hank ’s 液 4 ℃连续冲洗24 h 。 7 标本置于磷酸盐缓冲液中保存。 8. 脱细胞后的软骨见图 1——图 5 1.4. PU 支架及 PU /脱细胞软骨基质支架制备: 将经环氧乙烷消毒的 PU 置于纯 1，4 一二氧六环溶剂中，在磁力搅拌机上搅拌 24 小 时，直至溶液变成透明，显示PU 已均匀的分布于 1，4 二氧六环溶液中，制备浓度为 7.5% PU 溶液。分装该溶液至直径为 2cm 的Teflon 试管并迅速放入 0℃ ,-10 ℃,-20℃的恒温冰箱 中凝固、结晶。同上述步骤，按PU 与脱细胞软骨基质质量构成比为 2:1 和 4:1 来配制 PU 浓度为 7.5% 的PU /脱细胞软骨基质溶液，然后迅速倒入试管后放入 0℃,-10℃,-20℃的恒温 冰箱中过夜保存。24 小时后将得到的凝固体在冷冻干燥机中干燥 48 小时，此时就制得温 度比例不同的 PU 和 PU/脱细胞软骨支架。 2. 支架各种性能的测定： 2.1. 亲水性测定： 将 10mg 支架材料置于 3ml 的 PBS(pH=7.2) 中并在20 ℃下孵育 1 小时，测量支架的湿 [9] 重。计算水结合力:水结合力=(湿重一干重)/干重 。 2.2. 支架孔径测定: 取制成的支架材料并切成薄片，应用图像分析仪计算每个薄片中的平均孔径，从而算 得不同实验条件