固氮酶催化N-%2c2-和H-%27%2b-还原机制.pdf

摘 要 尽管当前人们对固氮酶的结构和功能的认识已达到了原子水平，但对固氮酶活性中心 FeMoco中催化底物N2和H+的还原位点，及用于还原反应的质子和电子通道，至今仍未确定。 本论文中．通过定点突变及基因替代技术，成功构建了四个尼pneumoniae固氮酶突变 体MoFe蛋白，其中：两个为单突变体，将野生型固氮酶钼铁蛋白Ⅸ亚基中．铁钼辅因子(FeMoco) a190和His 周围多肽链的Gin 个为双重置换的突变体。将上述两个氨基酸单独替换突变分别引入．／ff突变株(niff‘，与 Nif、r Kpl)。 在固氮条件下，所构建吲氮酶突变菌株均表现为严格的Nit表型，不能进行固氮生长。 大量培养各突变株并充分诱导细胞固氮酶的表达，利用相同的柱层析和制备电泳程序纯化了 四个突变体固氨酶以及来自野生型和删壤变株的MoFe蛋白及野生型Fe蛋白。对比分析了四 的位点。 四个突变体固氮酶、野生型和NifV固氨酶的MoFe蛋白的底物还原特性比较表明：(1) a-Gin”4替换不影响固氮酶还原质子时的总电子流；尤其引人注意的是，含有a-Lys…和柠檬 酸双重替换的MoFe蛋白几乎完全失去了质子还原的能力。(2)a-Gin“替换与其它两个替 MoFe蛋白放氢的最大抑南4率为71％，a-