内蒙古绒山羊精液冷冻保存研究.pdf

本研究由 资助基金项目：国家绒毛用羊产业技术体系项目(CARS-40-8);国家 “863”计划(2007AA10Z151) Assistance Fund Project: the National System of Industrial Technology villi project with cashmere goat (CARS-40-8); 863program (2007AA10Z151) 摘 要 内蒙古绒山羊产于内蒙古鄂尔多斯市、阿拉善盟和巴彦淖尔盟，具有繁殖力高， 适应性强，产绒量多，绒毛细等特点。用冷冻精液通过人工授精技术可以加速优良 种群扩繁，加快绒山羊良种化进程。但是由于山羊精子的生理特点，其冷冻效果自 然很低，目前仍未形成一种有效的冷冻保存技术程序。 为了进一步改善绒山羊冷冻精液品质，本研究在改进绒山羊冷冻方法与优化 冷冻稀释液方法进行了研究，以精子活率、质膜完整性、线粒体活性、顶体完整率 和 DNA 完整性等为检测指标，利用荧光显微镜结合流式细胞术以及一些常规检测手 段对精子品质进行了客观有效的评价，目的是研究出适合内蒙古绒山羊精液冷冻保 存的稀释液配方和冷冻程序。为绒山羊精液冷冻的实际应用奠定基础。 本论文主要分五个部分对精子冷冻技术进行了研究，结果如下： 1.对精液冷冻程序进行了系统优化研究。结果表明：（1）稀释比例 1：3 （v/v）， 去除精浆，一步法稀释，采用缓慢降温法 (降温前在室温下静置 10 min),降温 3 h； （2）平衡后放在距液氮面4 ㎝处薰蒸，时间为 10 min；（3）用较高温度解冻，55℃ 水浴 6 s；解冻后精液放入 37℃水浴锅内孵育 10 min，精子复苏后进行指标的评价 冷冻效果最优。 2.通过逐步法对国内外 9 种较好的稀释液进行筛选，筛选出最好的基础液为 D 组（Tris 3.07g、柠檬酸 1.64g、葡萄糖 0.5g、果糖 0.66g，卵黄 5%），平均活率 达 41.21%，顶体完整率和质膜完整性平均分别为 75%、62.27%，效果显著优于其他 组（p0.05）。 3.不同添加成分对精子冷冻效果的研究。筛选出三类物质的最优成分和添加 量：（1）糖类在稀释液中属于非渗透性冷冻保护剂，在稀释液中具有维持渗透压和 给精子供能等主要作用，在蔗糖、海藻糖和葡聚糖 3 种糖的添加比较研究中确定海 藻糖能有效的提高精子解冻后的质量，添加后活力平均达到 0.44，优于其他组 （p0.05），最佳添加终浓度为 62.5mM；（2）研究 4 种渗透性抗冻剂对精液冷冻的 效果。结果表明：甘油对精子的冷冻保护效果最佳，平均活率 0.42，优于其他组 （p0.05），添加浓度 5% （v/v）；（3）稀释液中添加抗氧化剂的效果研究。抗氧化 剂具有清除精子代谢产生的活性氧簇 ROS 和减弱不饱和脂防酸的氧化等作用，关于 L-谷氨酸、 β-巯基乙胺、亚牛磺酸的报道较少，本试验在 D 组稀释液的基础上， 研究 3 种不同浓度的抗氧化剂对山羊精子冷冻效果的影响。结果表明，3 种抗氧化 剂对冷冻后精子活率都显著提高（p0.05），但 L-谷氨酸对山羊精子的冷冻保护效 果比 β-巯基乙胺和亚牛磺酸明显（p0.05），添加L-谷氨酸后活率平均达到 0.48， 最佳添加浓度为 5 mM。 4.本实验用 AO(吖啶橙)染色方法研究冷冻前后精子的 DNA 完整性，分析冷冻是 否对精子 DNA 造成进一步的损害，海藻糖在山羊精子冷冻-解冻过程中可以改善精 子的质量，对精子 DNA 的完整性的保护作用优于其他组（ｐ0.05）；细管冻精在高 倍稀释与低倍稀释相比，可明显增加解冻后精子 DNA 的损伤程度，通过精子细胞的 TUNEL 凋亡测定，冷冻前后对精子 DNA 的损伤程度不明显或不显著（ｐ0.05）。但 添加保护剂后可加剧 DNA 的损伤程度（ｐ0.05）。 5.为了最大限度地利用优良种山羊的遗传资源，进一步研究了附睾精子的冷冻 效果，通过对山羊附睾精子的冷冻效果研究，结果表明：山羊附睾精子能够成功地 冷冻保存，冷冻效果优于射出精子的冷冻效果，冷冻后活率平均达 0.55。 综上所述，本实验通过筛选内蒙古白绒山羊精液冷冻-解冻程序和稀释液配方 的优化组合，在 5%的甘油下添加海藻糖（62.5 mM）和L-谷氨酸 (5 mM)