兔出血症病毒衣壳蛋白缺失株的拯救及复制特性研究.pdf

。＼ ＼ 4 I I I IIIII I I IIII I III lIII ＼1735138 f 摘要 兔出血症病毒(Rabbit diseasevirus，RHDV)是一种具有强烈感 hemorrhagic 染性和致死性的动物病毒，它属于杯状病毒科，兔病毒属。深入研究RHDV致病 机理对于更好地防控该病具有重要意义。衣壳蛋白是RHDV最重要的一种结构蛋 白，它不仅决定了病毒的免疫原性，在侵染宿主，感染致病等方面也发挥重要的 作用。迄今，关于衣壳蛋白与RHDV的侵染性和病毒的复制等之间的关系还不清 楚。鉴于此，我们拟在前期研究基础上，利用反向遗传学技术研究衣壳蛋白与 RHD病毒的侵染性和病毒基因组复制等之间的关系。 变体RNA，将之转染RKl3细胞，同时与完整病毒RNA进行对比。分别利用间 接免疫荧光、RT—PCR和实时定量PCR等方法检测衣壳蛋白缺失突变后，对病毒 的侵染性和病毒基因组复制等方面的影响。 研究表明，突变体RNA转染细胞后，仍能拯救出病毒，且再次接种正常RKl3细 胞，仍能产生明显细胞病变(CPE)，表明病毒缺失衣壳蛋白后仍具有侵染能力。 应用RT—PCR方法分别检测感染细胞中的正链和负链RNA，结果均扩增出目的基因， 提示病毒突变体基因组在细胞中进行了复制。使用间接免疫荧光检测RHDV的蛋白 情况，结果表明在感染细胞中存在较多的特异荧光，证明在细胞中存在病毒蛋白 的表达。此外，还用实时定量PCR方法对RHDV突变体基因组的复制情况进行了检 病毒基因组的复制，基因组拷贝数为4．66×105基因拷贝／lIlL，在第24h，基因组的 X 拷贝数达到峰值(1．11 种细胞后，第6h也可以检测到病毒基因组的复制，基因组拷贝数为6．23×105基因 拷贝／mL，在第24h，病毒基因组的拷贝数达到峰值(8．81×108基因拷贝／mL)。 随后2个突变体病毒基因组的拷贝数都逐渐降低，证明病毒缺失突变以后在细胞 中可以正常复制，但是两个突变体之间的复制水品平稍差别，相对pBLRHDV—d (5325-693 } l 而言，两个病毒突变体的复制水平都明显降低，提示本研究中VP60的缺失区域可＼ 能存在一些与病毒复制有关的一些序列或元件，当然这还需要进一步研究证实。 关键词：兔出血症病毒：突变体：衣壳蛋白：反向遗传学 Abstract Rabbit disease thecausativeofa hemorrhagicvirus(RHDV)isagent highly diseaseofwildanddomestic tothe Caliciviridae, contagious rabbit，belongingfamily onthe ofRHDVis forbettercontrol genusLagovirus．Studypathogenesis helpful the