TPX2基因对宫颈癌生物学作用的实验与研究.pdf

中文摘要 TPX2基因对宫颈癌生物学作用的实验研究 摘 要 for kinesin．1ike 2是一个受细 目的：TPX2(targetingproteinXenopus protein 胞周期严格调控并在细胞有丝分裂纺锤体形成过程中发挥重要作用的微管相关蛋 白。有研究者发现其在某些恶性肿瘤中存在高表达，导致细胞中心体异常扩增、 异倍体形成及细胞恶性转化，进而促进细胞增殖，影响周期和凋亡，并与肿瘤分 化、转移和复发明显相关。阻断其表达可抑制止肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤治 疗的候选靶点。宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展和转归与多种 因素有关。TPX2是否参与其中，目前国内外尚未见报道。本课题研究了TPX2在 宫颈癌的表达及在体内外沉默后对宫颈癌细胞增殖、侵袭的影响，旨在为宫颈癌 诊治开拓新的靶点。 方法：本课题分总共分四部分，第一部分借助RT-PCR及免疫组化技术对宫 床病理资料进行分析，以探讨TPX2在子宫颈癌中的表达情况及其与子宫颈癌患者 临床分期、淋巴结转移及组织病理分化程度的关系，为宫颈癌的诊治提供新的依 据。第二部分研究了在宫颈鳞癌siha细胞沉默TPX2基因后其生物学行为的变化。 2000 介导siRNA转染siha细胞株。荧光显微镜测其转染效率。本实验所有检测项目都按 如下分组：实验中以PBS代替转染剂和siRNA混合物设置为空白对照组，转染阴性 表达的变化，并选择出最有效fl勺siRNA做后续实验。Westernblot检测转染前后蛋白 行孔，将各组细胞分别接种至96孔板培养24小时，按照操作步骤进行转染，分别 孔吸光度值，并据此绘制细胞生长曲线。流式细胞仪检测TPX2沉默后siha细胞的 小时，95％乙醇固定，结晶紫染色，显微镜下计数各组穿膜细胞数。第三部分研 中文摘要 进一步验证TPX2特异性I约siRNA在体内对宫颈癌细胞生长的影响。第四部分研究 瘤内定期注射治疗)，空白对照组(接种hela细胞成瘤后，生理盐水瘤内定期注射 治疗)。通过观察各组裸鼠皮下移植瘤的成瘤时间、绘制移植瘤体积生长曲线，移 因的沉默效应及TPX2．siRNA对HeLa细胞裸鼠移植瘤的抑制效果。 结果： 第一部分①经RT-PCR检测，正常宫颈组织中TPX2mRNA的相对表达 癌组织中相对含量为0．441±O．01 胞的表达为1．679±0．042，各组与正常宫颈组织比较均有统计学差异(P 癌hela细胞系均呈阳性表达，定位于细胞核。免疫组化法检测TPX2蛋白在 宫颈腺癌组织呈阳性表达，而正常宫颈腺上皮未见表达，两组间比较有统计 学意义。TPX2蛋自在正常宫颈鳞状上皮组织中不表达，在CIN和宫颈鳞癌 组织中阳性表达强度增加，三者之间差异具有显著性((PO．05)。③TPX2在宫 在高、中、低分化三组间的表达强度渐增加，三组间比较有统计学意义， (PO．05)；在有淋巴结转移组的表达强于无淋巴结转移组(P(0．05)。 u 1．t moL／L 第二部分①在600L转染体积中，在siRNA浓度为20 率达(62．5±1．26)％。④MTT法测定TPX2 siha细胞增殖的影响：转染TPX2 即出现增殖减慢，48h吸光度开始出现下降趋势，细胞增殖受到抑制，且随 着时间延长，抑制作用逐渐增强。在转染24、48、72、96h时间点的吸光 中文摘要 组及转染阴性siRNA对照组组均随着培养时间的延长，吸光度值逐渐增 (委)Transwell小室法测定TPX2 袭能力的影DR．TPX2 的穿膜细胞数比较无统计学差异， (P0．05)。⑥流式细胞术检测 TPX2．siRNA4对siha细胞周期分布的影响。经流式细胞仪检测分析， 照组和空白对照组在各组细胞比较无差异，(P