Ⅰ.PPARγ和小分子以及相关受体蛋白相互作用研究+Ⅱ.SARS冠状病毒刺突蛋白免疫片段热力学和动力学研究.pdf

捅要 本博士论文是由两个独立的研究课题组成： I．PPART与小分子以及相关受体蛋白的相互作用研究 PPAR是一类与脂肪和糖类代谢密切相关的核受体，它与配体以及别的核受 体作用能够有效地调控下游基因的表达，而影响人的各种生理作用。目前对于受 体与配体以及受体蛋白之间相互作用的研究相对较少，并缺乏定量的研究数据。 本论文旨在从分子水平上对PPAR与小分子以及相关受体蛋白的相互作用研究 进行方法学的讨论。我们首次通过表面等离子共振技术、圆二色谱以及分子对接 模拟等方法研究了一系列PPA脚配体与PPAR丫配体结合部位的相互作用。表面 等离子共振生物传感器实验确定了这些配体与受体PPART作用时的解离平衡常 数与有文献报道的数据吻合；同时我们发现当PPARY结合配体后可以诱导其自身 构象的变化，并表现在二级结构的热稳定上，因此通过圆二色谱观察PPART结合 配体后的热稳定性，利用热稳定性参数与解离平衡常数之间的线性相关性就可以 获得与配体结合的信息，这种首次报道的方法为研究配体受体相互作用提供了一 条更为新颖的思路：分子对接模拟进一步在分子水平上对配体与受体相互作用的 模型做了讨论，并且对不同配体与受体的作用的结合强度差异在结构水平上进行 了解释，其结果与上述的两种实验方法具有极好的相关性。因此综合运用这三种 方法，不仅可以有效地分析现有的配体受体相互作用，而且对于新配体的发现， 甚至是新药的研制具有重要的意义。另外尽管PPAR和9一顺视黄酸受体RXR 的相互作用以及形成异源二聚体的过程己经有所研究，但是对于PPAR和RXR 结合亲和力从未报道，而且还没有证据说明配体在这个异源二聚体形成过程中的 定量诱导作用。我们在这里报道了PPARV配体结合部位与RXRa配体结合部位在 没有任何配体存在时仍然可以结合，这种结合尽管可以没有配体的参与，但是配 体可以有效地加强结合的强度。其中包括PPARV的激动剂以及RXR的天然配体 学分析证实配体参与下的蛋白间亲和力可以增加10一100倍；通过数据分析，我 们认为配体能够影响受体蛋白问相互作用的主要原因是由于配体直接诱导了受 体蛋白自身的巨大构蒙变化，该结果也在计算模拟中得到了相应地解释。 第1页 II．SARS冠状病毒刺突蛋白免疫片段的热力学和动力学研究 Acute 严重急性呼吸综合症(Severe Respiratory Syndrome，SARS)是一种严 重的呼吸道疾病，SARS冠状病毒被确认为该疾病的元凶，SARS冠状病毒的刺 突蛋白做为病毒的外层包被蛋白对于病毒进攻人体细胞具有非常重要的作用。本 纯化以及生化性质的讨论，为研究SARS刺突蛋白的结构和功能特性提供更多的 信息。含有该片段基因整合在pET32c载体中在大肠杆菌中获得充分高表达，带 有His等标签的融合蛋白利用柱上酶切法和分子筛层析进行了纯化。纯化后的 Slb蛋白通过圆二色性(CD)、色氨酸荧光分析和停流CD光谱分析等方法研究 了其热力学和动力学特性。荧光实验发现该片段在热变性过程中表面活化能为 热变性过程中没有二级结构的变化，说明该片段的二级结构骨架具有相对的热稳 定性。盐酸胍作为变性剂对于Slb影响较大，CD和荧光实验均证实盐酸胍变性 浓度(C。)约为2．38M。停流实验分别监测了该蛋白片段的盐酸胍化学变性和复性 过程，并首次利用动力学实验得到的驰豫时间(T)计算了变性浓度C。，这成为 了研究稳态和动态两种形式下蛋自变性过程的纽带。同时对于SARS冠状病毒 Slb片段的结构我们还进行了同源模建，得到的蛋白三维结构也验证了实验中获 得的Slb蛋白所表现出的各种热力学和动力学上的性质。综上所述本研究将有利 于进～一步探索Slb蛋白的作用、性质及功能，为基于Slb蛋白的抗体制备、药物 设计及筛选提供了全面的理论数据。 关键词：核受体；配体小分子：蛋白相互作用；冠状病毒；刺突蛋白免疫片段 第1I页 Abstract I．Interaction between