分子生物学常用技术及其应用.pptVIP

主要内容 基 因 工 程 重组DNA技术-基因工程 核酸分子杂交技术 PCR 技术 基因诊断与基因治疗  第一节基 因 工 程 基因工程的基本概念 工具酶 载体 重组DNA技术的基本原理 重组DNA技术的基本过程 基因工程在医学中的应用 一、基因工程的基本概念 DNA重组：不同来源的DNA分子可以通过末端共价连接而形成重新组合的DNA分子的过程。 基因工程：将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作。 二、工具酶 限制性核酸内切酶 其它工具酶 1、DNA连接酶 2、DNA聚合酶 3、逆转录酶 4、多核苷酸激酶 5、碱性磷酸酶 6、末端脱氧核苷酸转移酶 三、载体 质粒 噬菌体 粘粒 病毒 五、重组DNA技术的基本过程 目的基因的制备方法： 1、基因组DNA文库 2、制备cDNA文库 3、PCR 4、化学合成 六、基因工程在医学中的应用 医学基础的研究 疾病的诊断和基因治疗 基因工程药物 转基因动物 人类基因组计划 蛋白质工程 第二节 重组DNA技术-基因工程 重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。 一、限制酶 限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 1、限制酶的命名 根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。 2、限制酶识别序列和切割形成 每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。 ?  如：Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’ ? Bam HI 5’-GGATCC-3` 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差 　　 切割形成 粘性末端（sticky end）交错切。 部分常用限制酶及切点 互补末端连接 产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式： 1)用同一种限制酶切割； 2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割； 3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。 3、特点： 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途： 1) 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。 2) 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。 3)Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。 二、基因运载体及其选择 载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 载体具以下特征： 1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖； 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点； 3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。 常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。 （一）.质粒plasmid ?Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 ? ? PBR322