实验二鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其Westernblotting鉴定.docVIP

实验二 鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其Western blotting鉴定 将以上提取的水溶性蛋白和盐溶性蛋白进行Western blotting鉴定 实验目的和要求 了解从动物组织中提取蛋白的原理和实验方法。 熟悉蛋白质含量测定的各种方法和基本原理，并根据实验结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异。 掌握SDS的原理和垂直板型凝胶电泳的操作方法，并根据电泳结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。 掌握Western blotting操作方法。 实验仪器、材料和试剂 （一）仪器 微量移液枪及枪头、微量离心管（又称Eppendorf 管）、50ml离心管、常用玻璃器皿（见表1）、台式天平、组织捣碎机、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、垂直式电泳槽装置、凝胶成像系统。 （二）试剂准备 1．Buffer I（2000ml）：20mM Tris-Cl, pH8.0 。 2．Buffer II（500ml）：Buffer I含有0.5M NaCl。 四、实验操作 （一）动物肌肉蛋白的提取 1．称取新鲜的淡水鱼或海水鱼剔除鱼鳞、鱼刺及脂肪取肌肉，用刀切碎，称取3g左右，加入 30 ml 左右冰冷的Bufffer I（鱼肉[g]：Bufffer I[ml]=1:10），在捣碎机中捣碎成匀浆。 2．将以上匀浆转入50ml 离心管中，在4℃下，10000×g，离心15min，将上清和沉淀分开。 上清用四层纱布进行过滤除去脂肪，滤液即水溶性蛋白提取液（留样（1.5ml）、量体积、测蛋白含量、SDS化） 在以上沉淀中，加入30 ml 冰冷的Bufffer I，重悬沉淀，在4℃下，10000×g，离心15min， 取沉淀。 重复操作4一次。 在以上沉淀中，加入30 ml 冰冷的Buffer II，重悬沉淀，再次用组织捣碎机进行捣碎。 将以上匀浆转入50ml 离心管中，在4℃下，10000×g，离心15min，将上清和沉淀分开。上清即为盐溶性溶性蛋白提取液（留样（1.5ml）、量体积、测蛋白含量、SDS化） （二）蛋白含量测定（紫外吸收法） 取适量的样品提取液（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液），根据蛋白质浓度，用Buffer I适当稀释后，用紫外分光光度计分别在280 nm和260 nm波长下读取吸光度，以Buffer I为空白调零。 结果计算： 蛋白质浓度= n ×（1.45 A280－0.74 A260）（mg／mL） 式中：l.45和0.74为校正值； A280为蛋白质溶液在280nm处的吸光度； A260为蛋白质溶液在260nm处的吸光度； n为稀释倍数。 （三）蛋白提取液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 1． 聚丙烯酰胺凝胶的配制（1）分离胶(10%)的配制（10ml）： ddH2O 4.0 ml 30%储备胶 3.3 ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 2.5 ml 10% SDS 0.1 ml 10% AP 0.1 ml TEMED 4 μl 混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平（凝胶完全聚合需30-60min）。 （2）积层胶的配制（5ml）： ddH2O 3.4 ml 30%储备胶 0.83 ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.63 ml 10%SDS 0.05 ml 10%AP 0.05 ml TEMED 5 μl 将分离胶上的水倒去,加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间（完全聚合需15-30mim）。 2．样品处理：将样品（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液）加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热5min，离心12000g×1min，取上清作SDS分析，同时将SDS分子量蛋白标准品作平行处理。 上样：分别取10μl处理后的样品加入样品池中，并加入6μl蛋白标准品作对照。 电泳：在电泳槽中加入1(电泳缓冲液，连接电源，注意正负极接向。电泳时，刚开始电压控制在90V，当样品到达分离胶后，可将电压调至180V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止。 染色：将胶从玻璃板中小心取出，用考马斯亮兰染色液染色。 脱色；将胶从染色液中取出,放入脱色液中，脱色至蛋白带清晰。