dna分子标记原理与技术.pptVIP

分子标记技术可用于： 鱼类作为实验动物，比哺乳动物等具有更多的优点： 1、产卵量大 2、体外受精 3、体外孵化 ?聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。 PCR（聚合酶链反应）——快速取得大量DNA片段的方法 原料：样品DNA、引物（RNA）、DNA聚合酶、 脱氧核苷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP） 步骤：①变性 94-95℃ DNA双链解旋 ②退火 55℃ 与引物结合 ③复制 72℃ 应用：①生物进化和古人类学研究 ②法医学 RAPD RFLP 实验流程 DNA提取 限制性内切酶消化 电泳分离 放射自显影检测 RFLP 显性标记 or 共显性标记 PCR-RFLP 随机扩增多态性DNA（RAPD） RAPD是以基因组DNA为模板，以一个随机的寡核苷酸序列作引物通过PCR扩增反应，产生不连续DNA产物，用以检测DNA序列的多态性。 该方法的优点主要是: 简单易行、需要的DNA量极少（15-25ng）、无放射性、实验设备简单、周期短，因此受到研究者的普遍欢迎。 目前该方法已广泛用于种质资源鉴定与分类、目标基因的标记等研究上，也有人利用RAPD标记来绘制遗传连锁图。 RAPD标记技术:随机扩增多态 DNA Random Amplified Polymorphic DNA 利用随机合成的寡聚核苷酸序列（8～10bp）作为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。 扩增产物在琼脂糖凝胶或丙烯酰胺凝胶上电泳分离，并经溴化乙锭染色或银染色得到多态性的DNA图谱。 该方法的缺陷： 一，是多数位点的标记带表现为显性的特点，因此不能提供完整的遗传信息； 二，是该方法在一些作物上扩增产物的稳定性较差。 在使用这一方法时，应注意： 一，尽可能地把RAPD标记转化为更有效的经典PCR标记； 二，严格控制模板DNA和Mg2+浓度，严格保证反应条件、反应参数的一致性。 很难判断带的有无 背景影响严重 Ｑ：带的亮度差异很大？ 凝胶分辨率？ 6/50 利用RAPD研究分析鲂属团头鲂、三角鲂和 广东鲂的种间亲缘关系和种内遗传差异,发现团头鲂与三角鲂的亲缘关系较近。 RAPD标记在鱼类品系鉴定、遗传多样性检测等方面得到了和好的应用。 用足够量的RAPD引物可以筛选到某品系在某引物扩增下产生的特征标记条带，这种条带可用于鱼类品系的快速鉴定 应用 AFLP分子标记:扩增片段长度多态性Amplified Fragment Length Polymorphism 1、用成对的限制性内切核酸酶双酶切 基因组DNA； 2、产生的片段用接头（与酶切位点互补）连接起来； 3、选择特定的片段进行PCR扩增。 36/50 41/50 Bsp1286I RsaI HincII ScaI MboII RsaI 44/50 AFLP扩增可获得在某一品种出现而在另一品种不出现的特定的DNA谱带。因此，通过限制性酶切和PCR扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记。 AFLP非常适合绘制品种的指纹图谱及进行分类研究。 该项技术的特点是稳定性、重复性强。 该技术的缺点是技术难度大，同时成本也较高。 常用于品系鉴定、近缘物种遗传变异与系统发生分析。 由于其短期内产生大量的多态标记,使得AFLP在杂种（种内或种间）鉴定方面表现相当出色，尤其是在一些情况下可以解决其他标记无法解决的品系鉴定问题。 应用 简单重复序列（SSR） 真核生物基因组中散布有大量的小卫星和微卫星点。正因为真核生物中富含简单重复序列，而重复序列的两端往往是相对保守的限制性内切酶位点。所以通过特异性引物进行PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳（或聚丙烯酰胺凝胶电泳）和放射自显影（或银染），这样可以检测到在简单重复序列重复单位数不同的DNA区域的多态性。 SSR标记已被广泛应用于资源鉴定、连锁图绘制及目标性状基因的标记等研究上。 SSR有两大优点： 一是态性频率高，与RFLP标记相比SSR检测的多态性频率要高得多； 二是具有PCR方法所具有的优点，因为SSR除用作探针外，还可以通过PCR扩增植物基因组中所含的重复序列区域。 但是要克隆足够数量的SSR，并对基因进行测序和设计引物，没有足够的投资、人力和时间，是不可能实现的。 原位杂交（GISH或FISH）