食源性疾病药敏试验.ppt

2014年食源性致病菌药敏实验操作 北京市疾病预防控制中心 营养与食品卫生所 王迪 抗生素的选择 选择依据 临床与实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）推荐的药敏试验抗生素选择原则确定耐药监测的抗生素名单。 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗生素种类不同 革兰氏阴性菌抗生素的选择 革兰氏阳性菌抗生素的选择 抗生素的选择 表中推荐的抗生素为必做项目 监测手册建议各省结合实际情况增加抗生素种类 本实验室仅选择了以上表中的抗生素，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌各8种。 检测方法 CLSI推荐的体外抗生素敏感性试验方法 1.稀释法（琼脂稀释法或肉汤稀释法） 琼脂稀释法 常量肉汤稀释法 微量肉汤稀释法 2.扩散法（disk diffusion,K-B） 检测方法 食源性致病菌监测和食源性疾病监测的要求：通过方法的统一标准化得到具有可比性的结果 手册中要求采用微量肉汤稀释法 定量测定最低抑菌浓度（MIC） 检测方法-微量肉汤稀释法 实验室购置抗生素标准品，配置储存液，制备96孔药敏板（操作复杂，不同抗生素储存液的保存条件和时限不同，手工稀释可靠性重复性相对较差） 全自动药敏试验菌液接种判读仪（商品化药敏板，操作简单，结果稳定，重复性好，一次可处理大量样本，需购置仪器） 商品化的96孔药敏板（商品化药敏板，操作简单，无需配置抗生素储存液） 检测方法-微量肉汤稀释法 质控菌株的选择 革兰氏阴性菌-ATCC 25922 革兰氏阳性菌（金葡菌）-ATCC 29213 实验流程-菌株活化 前提：分纯的菌落 1.待测菌株和质控菌株接种BHI肉汤，37℃过（18-24小时）培养。（第1天） 2.从过夜培养的BHI肉汤管中挑取菌液，划线接种BHA平板，37℃过夜培养。 （第2天） 3.从过夜培养的BHA平板上挑取单个菌落，再次划线接种BHA平板，37℃过夜培养。（第3天） 注意：副溶血性弧菌的BHI和BHA需要含有3%的NaCl 实验流程-制备菌悬液 无菌棉签挑取上述经2次活化的菌落（待测及质控）≥3个，用2mL无菌生理盐水充分混匀（管壁充分研磨） 调整菌悬液浓度为0.5麦氏单位（梅里埃的浊度计） 吸取100μL菌悬液于10mLCAMHB肉汤中混匀，15min内使用，超过15min重新配置 注意： 1.研磨不开的菌落通过涡旋震荡处理 2.至少挑取3个菌落制备菌悬液，防止耐药质粒的丢失 实验流程-菌液接种药敏板 将与CAMHB肉汤混匀好的菌液接种到药敏板中 不同品牌的商品化药敏板的加样量不同，按照提供的操作说明进行操作 注意： 1.加样需使用带无菌滤芯的吸头 2.吸头不要接触孔内的冻干药粉，避免药物的相互作用 3.加样过程尽量快，30-60秒接种完毕，保持菌液的均匀性 4.从低浓度至高浓度一次加入，减少药物的相互作用，避免药物浓度受影响 实验流程-培养 温度：36±1℃ 时间：18±2h 培养箱中放置水槽（盛水的烧杯），保持培养箱中的湿度，防止加样孔中的水分蒸发。一旦蒸发无法判读结果。 药敏板尽量不要叠放，如果培养箱空间不够需要叠放，药敏板叠放不要超过4个 实验流程-结果判读 黑背景自然光线下肉眼观察 1.细菌生长的小孔：弥散状浑浊或小孔底部有圆形或网状沉淀 2.无细菌生长的小孔：清澈透明 无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度即为MIC 实验流程-结果判读注意事项 同时满足生长孔细菌明显生长，空白对照孔无细菌生长，质控菌株的MIC值在规定的质控范围内，结果可接受，否则重新试验 TMP/SMZ：以细菌生长数量较生长对照孔有80%或80%以上的减少为结果终点MIC 跳孔：出现单一跳孔，记录抑菌生长的最高药物浓度；出现多次跳孔，重复试验 商品化药敏板使用前要观察孔中的抗生素粉末是否有洒落，如果洒落不得使用。 商品化药敏板储存在-20℃冰箱中，平放，标签在上 实验流程-结果判读注意事项 向药敏板生产方索要抗生素浓度表和质控表 结果记录： 敏感（S） 中介（I） 耐药（R） 商品化药敏板 天津金章（我们使用过的产品） Thermo 谢 谢！ 联系方式 wangdi124@126.com * * TMP/SMZ Trimethoprim/Sulfamethoxazole 甲氧苄啶/磺胺甲恶唑 8