Biacore3000动力学和亲和力实验的设计方法-亲和力和动力.docVIP

Biacore3000_动力学和亲和力实验的设计方法-亲和力和动力 ? 结合 C 分子间结合的速度 ? 解离 C 分子复合物解离的速度 ? 动力学分析能够确定在一个给定的时间跨 度内，分子复合物是否能够结合 还是完全解离 亲和力 ? 分子间结合的强度? C 与时间无关 ? 亲和力分析能够确定反应处于平衡状态（ 结合与解离形成动态平衡）时， 复合物的浓度 2 / GE Title or job number / 2009-7-20动力学分析和亲和力分析的相关性? 细胞本身就是一个动态系统 C 极少处在平衡状态 同样的亲和力，不同的反应，动力学数据一般并不相同 ? 动力学数据提供了更多的信息 3 / GE Title or job number / 2009-7-20同样的亲和力，不同的动力学 -8 ? 所有4个化合物的亲和力数据相同 K = 10 nM = 10 M D ? 结合动力学常数可有不同数量级范围内的改变，本例中为4个数 量级 浓度 = 1000 nM 浓度 = 100 nM 所有靶位 点被占据 k k on off -1 -1 -1 (M s )(s ) 6 -2 10 10 5 -3 10 10 4 -4 10 10 3 -5 10 10 30 60 30 60 min min min min 时间 时间 4 / GE Title or job number / 2009-7-20 Response用Biacore获得动力学和亲和力数据的2种方式 监测结合和解离速率 ? 亲和力 动力学 监测稳态水平 ?亲和力 动力学 5 / GE Title or job number / 2009-7-201:1 动力学模型的速率方程 k a A B AB B k d A d [AB] k [A] [B] Association: a dt B -d [AB] k [AB] A Dissociation: d dt Net rate equation: d [AB] k [AB] k [A] [B] d a dt -1 -1 -1 M/s M s MM M s where -1 -1 k association rate constant [M s ] a -1 k dissociation rate constant [s ] d 6 / GE Title or job number / 2009-7-20平衡常数(Equilibrium constants) At equilibrium: Association Dissociation k kd [A] [B] [AB] a -1 -1 -1 s MM s M M The equilibrium constants: k [AB] -1 a K the equilibrium associationconstant [M ] A k [A] [B] d k [A] [B] d K the equilibrium dissociation constant [M] D [AB] k a 7 / GE Title or job number / 2009-7-20Biacore中的平衡和动力学 k a A + B ? AB k d A 是溶液中的待分析物(analyte) ? A的游离浓度由流动系统控制，在检测中保持恒定 AB 是结合复合物 ? AB的浓度可通过直接检测RU得到，表示为R B 是偶联在传感芯片上的分子 ? 总浓度能用 RU表示, 相当于最大结合反应理论值 R ? B的游离浓度即 R-R 我们无需知道复合物和配体的实际浓度！ 8 / GE Title or job number / 2009-7-20Biacore中的速率和亲和力 k a A B AB k d d[AB] k [AB] k [A] [B] d a dt dR k C [R R] k R a d dt -1 -1 -1 M sMRU sRU RU/s A has one binding site and reacts with immobilized ligand B has n identical and independent binding sites 9 / GE Title or job number / 2009-7-20传感图中的变量和表示方式 10 / GE Title or job number / 2009-7-20传感图中的信息 R , R 和 K 的关系 eq D 11 / GE Title or job number / 2009-7-20物质迁移（Mass