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细胞化学成分显示 酸性蛋白质、碱性蛋白质的显示 DNA、RNA的显示 实验目的： 1.了解细胞化学反应基本原理 2.了解细胞内酸性蛋白和碱性蛋白、DNA和RNA分布状况 3.熟练血涂片技术 实验准备 1、材料 蟾蜍 洋葱 2、仪器和器材 光学显微镜 解剖器械 载玻片 染色缸 水浴箱 3、试剂 70%乙醇 5%三氯醋酸 0.1%碱性固绿染液 0.1%酸性固绿染液 丙酮 甲基绿-哌罗宁染液 实验内容： 细胞内酸性蛋白、碱性蛋白的显示 细胞内DNA和RNA分布 原理： 细胞内不同蛋白质分子中所带的碱性基团(-NH2)和酸性基团(-COOH)的数量不同，在不同PH溶液中，整个蛋白质所带静电荷多少也不同。 在一定生理条件下： 整个蛋白质所带的负电荷多（-COO-），就为酸性蛋白；其主要分布在细胞质中。 整个蛋白质所带的正电荷多（NH3+），就为碱性蛋白，其主要分布在细胞核内。 标本经三氯醋酸处理抽提掉核酸后，用不同pH值的固绿染液分别染色，使细胞内的碱性蛋白与酸性蛋白质显示出来。 步骤： 处死蟾蜍，制作三张蟾蜍血涂片，晾干。 两张 70%乙醇固定6min 90℃、5%三氯醋酸、15min 冲洗 一张酸性固绿5-10min、另一张碱性固绿30-40min 冲洗晾干、观察 酸性蛋白：细胞质、核仁区域内的蛋白 碱性蛋白：细胞核内组蛋白 处死蟾蜍的方法： 左手握住蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。在头与躯干之间可触及一凹陷(即枕骨大孔所在处)，右手持解剖针直插入此凹陷约2 mm，将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。将解剖针向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。直至其四肢伸直、肌肉松驰为止。 二.细胞内的DNA、RNA分布 原理： 核酸是呈酸性，与碱性染料甲基绿-哌罗宁是具有亲和力，这两种碱性染料有选择的特异染色，甲基绿把DNA染成绿色，哌罗宁把RNA染成红色。 步骤： 血涂片，70%乙醇固定6min 晾干 甲基绿-派罗宁滴染20min 冲洗，吸干 丙酮分色（沾2-3次）晾干观察 一小块洋葱表皮 甲基绿-哌罗宁滴染30-40min 滴水冲洗 盖片、观察 蟾蜍血涂片：细胞质红色、核蓝绿色、核仁紫红 洋 葱 表 皮：细胞质红色、核绿色 处死蟾蜍，制作三张蟾蜍血涂片，晾干。 两张 70%乙醇固定6min 90℃、5%三氯醋酸、15min 冲洗 一张酸性固绿5-10min、另一张碱性固绿30-40min 冲洗晾干、观察 血涂片，70%乙醇固定6min 晾干 甲基绿-派罗宁滴染20min 冲洗，吸干 丙酮分色（沾2-3次）晾干观察 一小块洋葱表皮 甲基绿-哌罗宁滴染30-40min 滴水冲洗 盖片、观察 Fast green Methyl green-pyronin * * 蟾蜍红细胞 洋葱表皮细胞 一、酸性蛋白质、碱性蛋白质的显示 将推片自血滴左 侧向右移动 将推片自血滴左 侧向右移动 当血滴均匀地附着在两片之间后，再将推 片向左平稳地推移 DNA, RNA 洋葱内表皮细胞甲基绿-哌罗宁染色 DNA被甲基绿染成绿色 RNA被哌罗宁染成红色 细胞组织化学法：在保持细胞结构的基础上，利用某些化学试剂与细胞内的一些物质发生化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀在通过显微镜对细胞内的化学成分进行定位定性的检测方法。 三氯醋酸的作用：抽提DNA 、RNA，使蛋白质与DNA 、RNA分开。 固定：将细胞杀死，使其仍然保持原来的结构和形态。 甲基绿-哌罗宁染色原理：核酸是强性酸，甲基绿-哌罗宁是碱性染料，具有亲和力，这两种碱性染料有选择的特异染色，甲基绿把DNA染成绿色，哌罗宁把RNA染成红色。 -COOH -NH2