生物化学经典实验——DNA琼脂糖凝胶电泳.pptVIP

DNA琼脂糖凝胶电泳 实验原理 琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型凝胶 ——分离、鉴定、纯化DNA 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。 实验原理 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带, 从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。 此外, 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带, 用于以后的克隆操作。 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。 影响DNA迁移率的因素 影响DNA迁移率的因素：DNA分子的大小、构 象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成等 缓冲液pHDNA pI，DNA带负电荷，迁移率与 分子量对数成反比 DNA分子构象影响迁移率：共价闭环DNA线 状DNA开环DNA DNA片段越长，泳动速度越慢 在低电压时，泳动速度与电场强度成正比 不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围 琼脂糖浓度（W/V,%） 分离范围（kb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 嵌入染料的存在 　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA, 染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强, 还会使线状DNA迁移率降低15％。 离子强度影响 　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在无离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶), 电导率最小, DNA几乎不移动; 在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液), 则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 琼脂糖凝胶中DNA的观察 溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 桔红色荧光 主要实验器材 电泳槽结构 缓冲溶液配制表 电泳指示剂 核酸电泳常用的指示剂有两种: 溴酚蓝(bromophenol blue, Bb )呈蓝紫色；二甲苯腈( xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 操作步骤 琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相 溶 胶 准备胶槽 凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml 铺 胶 凝胶凝固后取出梳子 加电泳缓冲液 准备样品 点 样 电 泳 注意观察溴酚蓝染液的迁移 紫外灯下观察电泳结果 照 相 * * DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。 电泳仪 电泳槽 缓冲液 琼脂糖 凝胶槽 梳子 取液器 溴酚蓝 0.15kb 0.2kb 0.6kb 1kb 溴酚蓝 2 1.4 1 0.6 胶浓（%） 1.6kb 2kb 二甲苯腈 *