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生物医药工程系《生物化学实验》预习报告 姓名 钟伟东 学号 专业 生物科学 班级 生物科学 日期 10.16 实验名称 氨基酸纸层析法 实验目的 1、学习并了解分配层析的原理； ? 2、掌握纸层析法分离氨基酸的原理和步骤。 实验原理 纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法又称纸色谱法，是用滤纸为支持物，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示： 在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断。 样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法。 氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用。所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生（亮）黄色物质。 仪器及材料（型号、规格、数量等） 大烧杯（5000mL）：1只/组 毛细管。 喷雾器：公用。 培养皿：1只/组。 层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤纸）：1张/组。 直尺、铅笔：自备。 电吹风：1只/组。 托盘、针、白线：1套/组。 手套：1双/组。 塑料薄膜：公用。 小烧杯：50mL，1只/组。 实验试剂（配制方法、数量多少、用途） 1实验器材 滤纸、烧杯10ml(×1)、剪刀、层析缸（×2）、毛细血管、电吹风（×1） 2实验试剂 (1)氨基酸溶液：赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸溶液以及他们的混合溶液 (2)溶剂系统 碱相溶剂：V[正丁醇（A.R.）]:V(12％氨水):V(95％乙醇)=13:3:3 酸性溶剂: V[正丁醇（A.R.）]:V(80％甲酸):V(水)=15:3:2 (3)显色贮备液:V(0.4mol/茚三酮-异丙醇):V(甲酸):V(水)=20:1:5. 实验步骤 滤纸准备：选用新华1号滤纸，裁成24cm×28cm的长方形，在距纸一端2cm处用铅 笔轻轻划一基线，在线上每隔3cm，画一小点样的原点。 点样：氨基酸点样量以每种氨基酸含5-20ug为宜，用微量注射器或微量吸管，吸取 氨基酸样品10ul点于原点(分批点完)，用吹风机稍加吹干后再点下一次，重复2～3 次，点子直径不能超过0.5cm。 展层和显色：将点好样的滤纸，用白线缝好，制成圆筒，原点在下端，浸立在培养皿 内，不需平衡，立即展层，展层剂为酸性溶剂系统[V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15:3:2]，把展层剂混匀，倒入培养皿内，同时加入显色贮备液(每10ml展层剂加0.1-0.5ml的显色贮备液)进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿1-2cm时。 显色：展层毕，取出滤纸，用热风吹干，蓝紫色斑点即显现。 结果：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之 间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的 R f 值，与标准氨基酸的 Rf 值对照，确定混合物中含有哪些氨基酸。 结果计算公式（要求计算的） 无 注意事项 ⑴.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。 ⑵.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。 ⑶.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。 ⑷.展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。 ⑸.如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的Rf值十分接近时，单向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转90度角，用另一溶剂系统展层。所得图谱分别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定。 疑难问题 何谓Rf值？影响Rf值的主要