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第一章 蛋白质的分子结构及研究技术 1.氨基酸的分类 按R 基团的极性分类 ?1)具有非极性或疏水R基团的氨基酸：8种，分别是丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，缬氨酸 ?2)具有极性不带电荷R基团的氨基酸：7种，分别是丝氨酸，苏氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，甘氨酸，酪氨酸 ?3)R基团带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)：（pH高于3时带负电）2种，分别是天冬氨酸，谷氨酸 ?4)R基团带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)：（生理pH带正电）3种，分别是赖氨酸，精氨酸，谷氨酸 此外,蛋白质的稀有氨基酸：基本氨基酸的衍生物，没有相应的三联密码子。 第21、22种氨基酸：硒代半胱氨酸，吡咯赖氨酸 2.概念： 蛋白质的一级结构：指氨基酸在肽链中的排列顺序。 蛋白质的二级结构：指多肽链主链有规律的折叠和盘绕，是多肽链主链局部的空间排列。维系二级结构的主要作用力是氢键。 蛋白质的超二级结构：在各种作用力的平衡下，若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的，在空间上可辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件，称为超二级结构，也称模体。 蛋白质的结构域：对于较大的蛋白质分子，多肽链往往形成几个紧密的球状构象，这些球状结构之间以松散的肽链相连，这些球状构象被称为结构域。 蛋白质的三级结构：多肽链借助各种次级键和二硫键，通过盘绕折叠，形成具有特定肽链走向的紧密球状构象，称为三级结构。 （蛋白质的三级结构指蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，但是不包括亚基间或不同分子间的空间排列关系。蛋白质的三级结构是建立在二级结构、超二级结构乃至结构域的基础上的。多肽链进一步折叠卷曲形成复杂的球状分子结构，称为三级结构。） 蛋白质的四级结构：具有三级结构的球状蛋白质以非共价键彼此缔合，形成一个高度有序的功能型聚集体，称为蛋白质的四级结构。蛋白质的四级结构包含了亚基的种类、数目、空间排布及亚基间的相互作用，但不考虑亚基本身的构象。 3. 蛋白质序列测定的一般策略 ⑴测定蛋白质分子中多肽链的数目 根据蛋白质N－末端或C－末端残基的摩尔数和蛋白质的分子量： ?若蛋白质只含一条多肽链，则蛋白质的摩尔数＝末端残基的摩尔数； ?若末端残基的摩尔数是蛋白质的摩尔数的倍数，则该蛋白质由多条多肽链组成； ?若末端残基多于一种，则蛋白质由两条或多条不同的多肽链组成； ⑵拆分蛋白质分子的多肽链（寡聚蛋白质） 多肽链（亚基）由非共价键缔合：变性剂如8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍、高浓度盐； 多肽链通过二硫桥(S-S)交联：氧化剂或还原剂将二硫桥断裂； 打开后单个多肽链可根据它们的大小或/和电荷的不同进行分离； ⑶断开多肽链内的二硫桥 多肽链内Cys残基之间的二硫桥必须在第4步前予以断裂：氧化剂或还原剂 ⑷分析每一多肽链的氨基酸组成 a.经分离、纯化的多肽链一部分样品进行完全水解，测定它的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比或各种残基的数目； b. 氨基酸组成的分析 水解（主要是酸水解，辅以碱水解） 酸水解： ?6mol/L HCl, 110℃,真空或充氮的安瓿瓶，10-24小时。（甲基磺酸）； ?所得氨基酸不消旋，但色氨酸全部被破坏，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸也遭到部 分破坏，同时天冬酰胺和谷氨酰胺被水解下来，生成相应的游离氨基酸和铵离子（酰胺基总量可以由水解液中的氨量算出）； 碱水解： ?5mol/L NaOH, 110℃,真空或充氮，20小时左右； ?多种氨基酸遭破坏，但色氨酸能定量回收； 氨基酸分析仪； 在不同的保温时间测出某氨基酸的含量并外推至零时间，求出该氨基酸在蛋白质中的真实含量； ⑸鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基 N-末端分析 二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法 游离末端氨基＋DNFB （Sanger 试剂）→DNP-多肽或DNP-蛋白质； ?酸水解→游离氨基酸＋DNP-N-末端氨基酸（黄色）； ?DNP-N-末端氨基酸用纸层析、薄层层析或HPLC进行分离鉴定、定量测定； （DNP：二硝基苯基） 侧链DNP衍生物用有机溶剂抽提区分； 丹磺酰氯（DNS-Cl）法 原理与二硝基氟苯法相同，用DNS代替DNFB试剂； ?灵敏度比DNFB法高100倍； ?水解后DNS-AA不需抽提，可直接用纸层析或薄层层析加以鉴定； 苯异硫氰酸酯（PITC）法 末端氨基＋PITC (Edman试剂)→苯氨基硫甲酰多肽/蛋白质（PTC－多肽/蛋白质）； ?酸性有机溶液中加热，N-末端的PTC-AA发生环化→苯乙内酰硫脲（PTH)衍生物； ?PTH-AA经有机溶剂抽提干燥，用薄层层析、气相色谱或HPLC进行鉴定； 此方法还可用来测定氨基酸序列； 氨肽酶法：肽链外切酶 氨肽酶（amino pe