引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增_医学论文.docVIP

引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增_医学论文 引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增_医学论文 【摘要】 目的 探索巢式PCR非特异性扩增的产生原因及消除方法。方法 以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒（HBV）S gene为模型，分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增，观察并分析实验结果。结果 降低引物浓度或提高退火温度均可消除巢式PCR的非特异性扩增，但提高退火温度有可能影响反应的扩增效率，导致产物量下降甚至得不到产物。结论 巢式PCR发生非特异性扩增时，可以提高退火温度或降低引物浓度对反应体系进行优化。 【关键词】 巢式PCR HBV S gene 非特异性扩增 Abstract：Objective To find the reason of causing nonspecific amplication in nested PCR and abate it.Methods To amplify HBV S gene by Nested PCR in different primer concentration and annealing temperature and observe the result.Results Both elevating annealing temperature and decreasing primer concentration can abate nonspecific amplication in nested PCR.But elevating annealing temperature may affect the amplifying effciency that result to decrease or eliminate the PCR products.Conclusion When nonspecific amplication happened in nested PCR,both elevating annealing temperature and decreasing primer concentration can optimize the reaction system. Key words:nested PCRHBV S genenonspecific amplication 常规PCR扩增技术应用一对引物扩增目的基因片段，灵敏度和特异性有时达不到实验者的要求。Mullis［1］在常规PCR基础上建立了巢式PCR（nested PCR）。巢式PCR采用两对PCR引物，进行两轮PCR扩增。使用外侧引物进行第1轮PCR，得到的扩增产物作为第2轮PCR的模板，再使用内侧引物进行第2轮PCR扩增目的片段［2］。 无论是常规PCR还是巢式PCR，实验者经常会受到非特异性扩增的困扰。从电泳结果上看非特异性扩增表现为与目的片段长度不符的DNA条带或大片弥散状拖带。根据发生机制，非特异性扩增可大致分为两类：第一类非特异性扩增是由引物与模板的非特异性结合引起的，第二类非特异性扩增是由引物与引物之间发生连接引起的。 扩增病毒基因组目的片段时，由于病毒基因组内同源性高，使用常规PCR易发生第一类非特异性扩增，即扩增产物为基因组内其他同源片段，而非目的片段。巢式PCR以第1轮PCR的产物作为第2轮PCR的模板进行两轮PCR扩增，从模板方面保证了片段的特异性，降低了第一类非特异性扩增的发生机率。并且由于病毒基因组的含量一般都较低，使用常规PCR扩增得到的产物量经常不能满足后续实验的需要，而使用巢式PCR，可通过两轮PCR扩增显著提高产物量，从而达到后续实验的要求［3］。但另一方面，连续使用两个PCR反应体系进行两轮PCR扩增，特别在第2轮PCR扩增时反应体系中同时存在2对引物，因而增加了发生第二类非特异性扩增的机率，对后续实验造成严重干扰。 以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒（HBV）S gene［4,5］为模型，分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增，观察它们对非特异性扩增的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 HBV感染者血清由成都医学院第一附属医院感染科提供。 1.2 主要试剂 小量病毒DNA提取试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司；Taq酶购自MBI公司；外侧引物PreS2：5-GGGACACCATATTCTTGG-3与S1R：5-TTAGGGTTTAAATGTATACCCA-3及内侧引物YS1：5-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3与YS2：5-GGGACTCAAGATGTTG TACAG-3［5,6］由上海生工合成；电泳级琼脂糖购自西班牙BIOSCIENCE公司；DNA标准品DL2