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恶性疟原虫MSP1_医学论文 恶性疟原虫MSP1_医学论文 作者：张忠广，常志尚，赵恒梅，宫玉香 【关键词】 疟原虫 ［摘要］ 目的 构建恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端相对分子质量1.9万片段（MSP119）毕氏酵母真核表达克隆。方法 利用PCR技术扩增出MSP119，插入pPIC9载体中，鉴定正确的MSP119基因，插入毕氏酵母分泌型表达载体pPIC9k中，DNA测序鉴定序列的正确性，转化酵母细胞。结果 筛选出的阳性克隆为MSP119表达克隆。结论 用分子生物学方法重组构建的MSP119毕氏酵母真核表达克隆，为高效表达MSP119及其活性鉴定奠定了基础。 ［关键词］ 基因，MSP119；基因扩增；疟原虫，恶性；毕氏酵母；真核表达；聚合酶链反应 ［ABSTRACT］ObjectiveTo construct MSP119 gene eukaryotic expression clones in pichia pastoris.MethodsMSP119 genes were amplified by PCR technique from recombinant vector pPIC9/PFCP2 and inserted into cloning vector pPIC9. Recombinant expression vectors were constructed by ligation with pPIC9k vectors. The validity of these sequences were confirmed by automatic DNA sequencing. By using electroporation transformation, recombinant expression vectors containing MSP119 genes were transformed into pichia GSll5 cells. ResultsThe positive clones were identified with recombinant MSP119 gene clones.ConclusionThe construction of MSP119 gene expression clone with molecular biology is the basis of MSP119 expression in pichia pastoris. ［KEY WORDS］genes, MSP119 gene amplification plasmodium falciparum eukaryotic expressionpichia pastorispolymerase chain reaction 随着分子生物学技术的发展，基因工程疫苗的研制已成为当今世界性热点课题。毕氏酵母表达系统既具有原核表达系统能高效表达外源蛋白的特点，又具有真核生物的翻译后加工功能，使表达的外源蛋白具有生物学活性［1］，所以构建酵母表达克隆意义重大。本文选择恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端相对分子质量19×103片段（MSP119）的编码序列为目的基因，与酵母表达载体pPIC9k进行重组构建，经酶切鉴定后获得MSP119的真核表达克隆。现报告如下。 1 材料与方法 1．1 材料及来源 大肠杆菌(Escherichia c01)DH5a，毕氏酵母(PichiaPastoris)GSll5组氨酸缺陷型表达菌株，pPIC9(8 023 bp,ColElori,AmpR)、pPIC9k(9 276 bp,ColElori,AmpR kanR)，均购自美国Invitrogen公司。质粒pBluescriptks+(2 960 bp，ColElori，Amp+)为实验室保存；pBKS／PFCP质粒为实验室保存。限制性内切酶购自BioLabs；T4 DNA连接酶，TaqDNA聚合酶购自MBI公司；DNA Marker购自Promega公司。 1．2 引物设计与合成 为便于目的蛋白纯化，在下游引物5′端加6个His基因，设计引物如下：上游引物P1：5′CCGCTCGAGAAAAGATTACAAATTTCTCAACATC3′；下游引物P2，5′CGGAATTCCTATTAATGATGATGATGATGATGATTAGAGGAAGAGCAGAAG3′。 1．3 MSP119片段的扩增及回收 取pBKS／PFCP2质粒模板DNA(0．5 g／L) 1 μL在50 μL反应体系中扩增，PCR混和液的组成：引物P1、P2各1 μL，4种dNTP混合物(每种10 mmol／L)1 μL，10×Buffer缓冲液5