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柴胡ISSR-PCR反应体系的建立与优化_药学论文 柴胡ISSR-PCR反应体系的建立与优化_药学论文 作者：隋春 魏建和 陈士林 杨新全 杨成民 【摘要】 　　目的建立适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系；筛选适宜引物，并确定最佳退火温度。方法CTAB法提取叶片DNA，通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR反应条件，利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系为25 μl总体积中含有1× Taq 酶缓冲液，2.0 mmol/L MgCl2，各0.15 mmol/L的dNTPs，0.3 μmol/L引物，1.5 U Taq酶(上海生工)，20 ng 模板DNA，2%去离子甲酰胺。在100条引物中筛选出30条扩增条带清晰且条带数目较多的引物，最佳退火温度为49.9～63.6℃（因引物不同而异）。结论建立了柴胡ISSR-PCR反应体系，筛选出30条引物并确定了最佳退火温度，为应用ISSR技术鉴定柴胡种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。 【关键词】 柴胡 基因组DNA提取 ISSR PCR 　　Abstract：ObjectiveTo establish and optimize the ISSR-PCR reaction system for Bupleurum chinense DC.; to screen the suitable primers and determine their optimal annealing temperatures. MethodsGenomic DNA was extracted by CTAB method from Bupleurum chinense DC. plant leaves. The main influencing elements in different levels were tested by single factor experiment. The gradient PCR was used to determine the optimal annealing temperatures of each selected primer.ResultsThe optimal reaction system for ISSR analysis contains 1× Taq DNA polymerase reaction buffer, 20 ng template DNA, 1.5 U Taq DNA polymerase, 2.0 mmol/L MgCl2, 0.15 mmol/L each of dNTPs, 0.3 μmol/L primer, 2% formamide deionized in 25 μl total reaction volume. 30 primers which showed clearer and more bands from 100 primers were selected and the optimal annealing temperatures were 49.9～63.6℃ (changed among different primers). ConclusionThe stable and reproducible optimal ISSR-PCR reaction system and suitable annealing temperatures of 30 selected primers from 100 are established for Bupleurum chinense DC. which had laid the good foundation for ISSR analysis on studies of germplasm resources identification, molecular marker assisted breeding and genetic diversity. 　　Key words：Bupleurum chinense DC.; Genomic DNA extraction; ISSR-PCR 　　柴胡为伞形科(Umbelliferae)柴胡属Bupleurum L.植物。属内植物种类很多，全世界约有150种，是伞形科中的一个大属。据中国植物志记载我国共有柴胡属植物36种，17变种，7变型［1］。包括柴胡属在内的伞形科植物的分类鉴定一直是植物分类研究的热点之一。分子生物学技术的应用能够为植物分类与进化研究提供更多分子方面的证据。目前已有利用脂酶同工酶谱带［2］、ITS序列分析［3，4］及RAPD方法［5