牛黄天龙胶囊（含药血清）诱导人子宫内膜癌 HECB细胞凋亡及其机制_药学论文.docVIP

牛黄天龙胶囊（含药血清）诱导人子宫内膜癌 HEC细胞凋亡及其机制_药学论文 牛黄天龙胶囊（含药血清）诱导人子宫内膜癌 HEC细胞凋亡及其机制_药学论文 作者：田彦玲，王玉花 ， 程建新，刘京生 【摘要】 目的 观察牛黄天龙胶囊（含药血清）对人子宫内膜癌HEC细胞能否诱导凋亡并对其抗癌机制进行探讨。方法 实验组分低、中、高3个剂量组并设空白组和阳性对照组进行含药血清的制备；MTT法观察细胞毒作用；细胞排染法观察瘤细胞直接损害实验；吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双荧光染色法及电镜（TEM）下观察细胞凋亡的形态学变化；流式细胞术（FCM）测定细胞凋亡率并进行细胞周期 分析，测定凋亡抑制蛋白survivin和凋亡效应蛋白Caspase的表达。结果 MTT法：人子宫内膜癌HEC细胞经含药血清作用后细胞生长受到明显抑制且以低剂量组抑制率最高。细胞排染法：同一时间段内以低剂量组效果最好，不同时间段内（24、48h）细胞抑制率显著提高(0.01)。AO/EB和TEM：实验组均可见到典型细胞凋亡的形态学变化。FCM：实验组各组细胞凋亡率与空白组相比差异有显著性(0.01)且以低剂量组最高，细胞周期分析显示实验组G0/ G1期细胞明显增多而S期细胞明显减少与空白组相比差异有显著性(0.01)，Survivin蛋白表达在空白组最高，在实验组表达降低与空白组相比差异有显著性(0.01)，Caspase3表达则相反，在实验组表达最高与空白组相比差异有显著性(0.01)。结论 复方中药 “牛黄天龙胶囊”（含药血清）能够使人子宫内膜癌HEC细胞生长阻滞在G0/G1期并可诱导人子宫内膜癌HEC细胞凋亡；并可降低凋亡抑制蛋白survivin表达同时可提高凋亡效应蛋白Caspase表达，这可能是其诱导人子宫内膜癌HEC细胞凋亡的机制之一；对人子宫内膜癌HEC细胞的抗肿瘤作用并非浓度越大效果越好而有一最适剂量。 【关键词】 血清药理学；细胞凋亡；AO/EB双荧光染色法；TEM；FCM. Key words：Pharmacology; Cell apoptosis; AO/EB double fluorescent dye staining; Transmission electron microscope；Flow cytometry 大量研究表明，复方中药制剂可通过阻滞肿瘤细胞生长周期，影响癌基因和抑癌基因表达等途径发挥抗癌活性[1]。我们所用方剂“牛黄天龙胶囊”，是在传统抗肿瘤中药方剂“犀黄丸”[2]基础上添加了新的抗肿瘤中药成分，针对妇科肿瘤而研制的新的抗癌组方。本研究运用血清药理学方法从细胞、分子和基因水平对牛黄天龙胶囊（含药血清）诱导人子宫内膜癌HEC凋亡的作用机制进行了初步探讨，旨在为筛选有效的抗妇科肿瘤的中药方剂提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物 Waster大鼠40只，雌性，清洁级动物，体重(280±30)g，合格证号：DK0402，由河北医科大学动物实验中心提供。 1.2 实验药物 复方中药牛黄天龙胶囊主要由牛黄、麝香、乳香、没药等十几味中药组方（生药购自河北省石家庄乐仁堂中药饮片厂）由河北医科大学第四医院药剂室按工艺制成，相当于含生药量每胶囊2.5g。 1.3 细胞株 人子宫内膜癌中分化细胞系HEC细胞由北京医科大学附属第一医院北京医院妇科科研室提供。 1.4 主要仪器和试剂 PRMI培养基为美国Gibco公司产品；胰蛋白酶，丫啶橙（AO），溴化乙啶（EB）由美国Sigma公司提供；胎牛血清由河北医科大学第四医院科研中心提供；顺铂（冻干型）购自山东省德州制药厂，产品批号031001；CO2培养箱，美国Forma Scientific公司产品；倒置相差显微镜（XS2型），荧光显微镜（Nikon UFX型）均购自日本Olympus公司；透射电子显微镜为日本日立H；流式细胞仪420为美国B．D公司产品。 1.5 方法 1.5.1 含药血清的制备[3,4] 将40只Wistar大鼠随机分成5组：阴性对照组（空白组），实验组（分高、中、低剂量组）和阳性对照组（顺铂组）。实验组高、中、低三组每日用药剂量分别按1/10LD50、1/20LD50、1/40LD50给药，以每只2ml /次灌胃，阳性对照组采用腹腔注射每只1ml /次（剂量按每只5mg/kg /天计算）。采用李仪奎“通法原则”方案，即每日剂量分2次灌胃（灌胃前禁食12h不禁水）连续3d，于第3d第1次给药2h后再给药一次，间隔1h以乌来糖腹腔注射麻醉，背位固定，无菌条件下腹主动脉取血，分离血清，56℃，30min灭活，0.2μm过滤除菌，分装，-20℃冰箱保存备用。 1.5.2 细胞培养 将人子宫内膜癌HEC细胞置于含10%胎牛血清的PRMI培养基中，在37℃