甘露消毒丹对温病湿热证大鼠TLR4mRNA、NFκBp65表达的影响_医学论文.docVIP

甘露消毒丹对温病湿热证大鼠TLR4mRNA、NF表达的影响_医学论文 甘露消毒丹对温病湿热证大鼠TLR4mRNA、NF表达的影响_医学论文 【摘要】观察甘露消毒丹对温病湿热证大鼠细胞内毒素Toll样受体4（TCR4)mRNA及核因子（NF表达变化的影响，探讨清热化湿方的治疗机制。【方法】将Wistar大鼠随机分为正常组、湿热模型组（高脂+高温高湿+大肠杆菌）、清热化湿组；采用逆转录-聚合酶链反应技术（RT）检测肝组织巨噬细胞TLR4mRNA，免疫组化技术检测肝组织巨噬细胞NF活化。【结果】模型组在感染6、12、24h不同时相点TLR4mRNA、NF表达逐渐增强，且不同时相点之间比较均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），说明随着病程的发展，湿热模型TLR4mRNA、NF表达逐渐增强。治疗组6、12、24h不同时相点的TLR4mRNA表达逐渐减弱：12、24h时相点治疗组与模型组比较，TLR4mRNA表达显著性减弱（P＜0.05，P＜0.01），但与正常组比较仍有显著性差异（P＜0.01），说明TLR4mRNA遏制衰减是一个缓慢的过程。而治疗组NF激活6、12、24h各时相点间比较均无显著性差异，且与正常组比较无显著性变化，但与同时点模型组比较均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。【结论】甘露消毒丹对温病湿热证大鼠肝巨噬细胞TLR4mRNA及NF表达具有较好的干预调控作用，能中止炎症介质的转录，限制急性炎症反应。 【关键词】甘露清毒丹药理学湿热证中药疗法基因表达调控疾病模型动物大鼠 温病湿热证是由湿热病邪引起的急性外感染病。其病因与发病正如薛生白所言：太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热，强调内外合邪、同类相召是发病之关键。其病理具有起病较缓，病势缠绵，病程较长的特点。王孟英曰：此（甘露消毒丹）治湿温时疫之主方也。……尚在气分，悉以此丹治之立效。如何认识和阐述此病机，目前文献鲜有报道。本实验拟观察甘露消毒丹对湿热证模型大鼠细胞内毒素Toll样受体4（TolllikereceptorTLR4)及核因子（nuclearfactor表达变化的干预，旨在细胞分子、生物学层次上探讨湿热致病机制现将结果报道如下： 1资料与方法 1.1动物清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量（200±10)g，由湖北省医学实验动物中心提供。 1.2药物及主要试剂与仪器大肠杆菌菌株AB94013由武汉大学微生物保藏中心提供，应用浓度为109/mL；清热化湿方由甘露消毒丹加郁金、姜黄组成（滑石30g，菌陈20g，黄芩20g，菖薄12g，川木通10g，川贝10g，藿香10g，射干10g,连翘10g，薄荷10g，白豆蔻10g，郁金15g，姜黄10g，以上药物均由湖北中医学院附属门诊部中药房提供，常规煎煮浓度为2kg/L药液，分装、灭菌，4℃冰箱保存；高脂饲料由武汉亚法生物技术有限公司提供，配方为普通饲料+25g/kg胆固醇+2g/kg胆酸钠+80g/kg蛋黄粉+100g/kg猪脂；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；逆转录酶、DNAMarker（美国Promoga公司）；TaqDNA聚合酶、DNTP（美国MBI公司）；免抗鼠多克隆NF美国chemTcoa公司）；PCR引物由上海生工公司合成；PCR仪（BiometreUNOⅡ,美国）；紫外可见分光光度计（U核酸电泳仪（北京东方仪器厂）；HMIAs彩色医学图文分析系统（湖北干屏影像公司）；人工气候箱（SHH型，重庆市永生实验仪器厂）。 1.3分组与造模［1-2］大鼠驯养3d后随机分为3组，各24只，分别为正常组：在正常温、温度环境下，普通饲料喂养29d。湿热模型组：在正常温、湿温度环境下，高脂饲料喂养2周后，每天择时放入人工气候箱中（温度35℃，相对湿度95%），时间为上8～12时，下午13～17时，纯度高脂饲料喂养；12d后灌胃大肠杆菌5×109/kg（预实验模索剂量），4h后，再加强灌服1次，继续放入人工气候箱观察1d。治疗组：整个过程同湿热模型组，灌服大肠杆菌前1天预服中药1次，造模后第1天灌胃3天，剂量为10g/kg，分别于感染6、12、24h时，处死各组大鼠取肝组织。 1.4TLR4mRNA的检测采用逆转录-聚合酶链反应技术（PT）。 1.4.1肝组织总RNA的提取及鉴定按TrizolReagent操作指南提取细胞总RNA。 1.4.2逆转录反应按SuperscriptTMPreamplicationSystem操作指南进行。 1.4.3PCR反应取2μLRT产物进行PCR反应。PCRR反应条件：95℃孵育5min，95℃变性45s，57℃（扩增不同片段采用合适的不同温度）复性50s，72℃延伸50s。末次循环72℃延伸10min。查基因库，设计