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水产微生物学实验 实验一 微生物基本操作技术（2学时） 一、教学目标与基本要求 掌握微生物实验中常用的基本操作 二、实验内容 实验报告 思考题 1、玻璃器皿清洗和包装有哪些注意事项？ 2、细菌接种时有哪些注意事项？ 实验二 细菌形态观察(2学时) 一 实验目的 1、掌握无菌操作技术 2、掌握细菌涂片的制作技术； 3、掌握显微镜特别是油镜的原理和使用方法； 4、掌握生物科学绘图的方法。 二 实验器材 1、器材：香柏油、油镜洗液、显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、小滴管、培养皿、酒精灯。 2、培养基和试剂：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面菌种。 三 操作步骤 1、细菌涂片的制作 (1)取菌 用无菌操作取菌。 (2)涂片 将带菌的液滴涂均匀。 应先在载玻片中央滴一滴生理盐水或蒸馏水，然后用接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂抹成适当大小的薄层。（无菌操作） (3)干燥 涂片最好在室温中自然干燥，必要时，可将标本面向上，在火焰高处烘干，切勿靠近火焰，以免标本干焦、菌体变形。 (4)火焰固定 将已干燥的标本片涂面向上，使背面在酒精灯火焰上以钟摆速度通过三次，使固定后的标本片触及皮肤时的稍感烧烫为度，但决不能在火焰上烧烤，否则，菌体形态毁坏。 2．显微镜观察 (1)低倍镜观察 将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。用4X或10X物镜观察找到合适的观察目标。 (2)高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，换用40X观察。 (3)油镜观察 在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 3、生物科学绘图 绘图时用铅笔以线条构成物体大约轮廓，或以“点”来表现物体，组成画面；或者在用线条构成物体的轮廓后，再用“点”的疏密来表现组织物体的层次结构紧密等。 实验报告 1、绘制油镜下观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌形态。 2、思考题 涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？ 使用油镜时，为什么必须用香柏油？ 实验五 细菌常用染色方法（2学时） 一 实验目的 1、巩固已学细菌涂片技术； 2、掌握细菌简单染色技术； 3、掌握革兰氏染色技术，并学习报告革兰氏染色的结果。 二 实验器材 1、器材：香柏油、油镜洗液、显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、小滴管、培养皿、酒精灯。 2、培养基和试剂：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面菌种；待测菌1-2种；美蓝染色液；革兰氏染色液（结晶紫染液、鲁戈氏碘液、95%乙醇、番红复染液）。 三 操作步骤 1、细菌涂片的制作 操作步骤同实验二。 2、简单染色法 只应用一种染料进行染色的方法。如美蓝染色法。 美蓝染色法：在已干燥、固定好的涂片上，滴加适量的（足够覆盖涂抹物即可）美蓝染色液，经1-2分钟，水洗、沥去多余的水分，吸干或自然干燥镜检。 3、革兰氏染色法 (1)在已干燥、固定好的涂抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，将菌膜覆盖为宜，经1-2分钟，水洗。 (2)甩去残水，滴加碘液染1-3分钟，水洗。 (3)脱色：滴加95%酒精2-3滴，频频摇晃3-5秒钟，使酒精能均匀布满涂面，斜持玻片使酒精流出，再滴加酒精，直至流下的酒精无色或稍呈淡紫色为止，之后水洗。脱色的时间，可根据涂抹片的厚度灵活掌握，通常在15-40秒之间。 (4)滴加番红复染液复染1-2分钟，水洗。 (5)用吸水纸吸干或自然干燥、镜检。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 (6)按上述方法，在同载玻片上，在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混合涂片染色镜检进行比较。（阳性紫色，阴性红色） 四 作业 1、分析几种细菌的革兰氏染色结果，阳性或者阴性？ 2、分析革兰氏染色过程中的注意事项有哪些？ 决定革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色时间过长，革兰氏阳性菌也可被脱色而误认为革兰氏阴性菌。反之，革兰氏阴性菌也可以误认为阳性菌，脱色时间长短又受涂片之厚薄、脱色时玻片摇晃的快慢及酒精用量多少等因素的影响，无法严格规定，一般可用已知的革兰色阳性菌和阴性菌作对照，可验证结果的准备性。 在染色过程中不可使染色液干涸。 选用适龄培养物，以培养18-24小进为宜，菌龄过长，由于细菌死亡或自溶也常使革兰氏阳性菌呈阴性反应。 涂片不宜过