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第四章植物基因工程在育种上的应用 王艳娜 本章主要内容： 第一节 目的基因的分离和克隆 第二节 植物基因工程载体 第三节 外源基因导入植物受体的方法 第四节 转基因植物的检测 第二节 植物基因工程载体 1．农杆菌载体系统 2．病毒载体系统 1．农杆菌载体系统 ①根癌诱导原理及Ti质粒 根癌农杆菌诱导的肿瘤称为冠瘿，而发根农杆菌则诱导发根。这些农杆菌中含有大量质粒，分别称为肿瘤诱导质粒(Ti质粒)和发根诱导质粒(Ri质粒)，这两种质粒均可使宿主发病。这两种病均是由Ti或Ri质粒的一些特殊组分转入植物细胞后与植物染色体进行功能整合而引起的。 后来的研究表明，在Ti质粒中，只有一小部分，即T-DNA或称转移DNA，被转入并整合到宿主植物核基因组中，而诱导形成冠瘿瘤的(Chiton等，1977)。 ②Ti质粒的构成 Ti质粒的基因结构：T-DNA区、Vir区、Onc区和Ori区共4个区段。 1 、Vir区(毒性区) 在Ti质粒T-DNA区的上游的一组基 因。表达产物激活T-DNA向植物细 胞转移，使植物引发肿瘤。 2、 Onc区 含有农杆菌之间接合转移有关的基 因. 3、Ori区(复制起始区) 调控Ti质粒自我复制。 ③农杆菌载体的构建 A．一元载体系统 有两种载体系统，即共整合载体(如pGV 3850共合体)和末端拼接载体(split-end vector，SEV)系统。 B．双元载体系统 双元载体系统由两个能在根癌农杆菌中自主复制的质粒组成：一个是在 T-DNA边界之间带有目的基因的穿梭载体(但更多是一个双元载体)；一个是辅助(helper)Ti质粒，该质粒带有vir基因，其产物有助于将DNA转移到植物细胞。 标准双元载体的组成成分： (1)多克隆位点； (2)广谱宿主范围的质粒复制起始点(如RK2)； (3)细菌和植物中的选择标记； (4)T-DNA边界序列(右边界序列是绝对必需的)。 双元载体的优点： 1)． 双元载体不需要在活体内进行同源重组。 2). 在农杆菌中，获得带有植物目的基因的双元载体系统比 较容易而且效率高。 3). 二元载体不会带入大量的无用的多余的DNA序列.因为一元载体的T-DNA区中含中间载体,他们会随同外源基因一起被转入植物细胞中. 2．病毒载体系统 目前，用于开发载体及转化的病毒有三种，他们主要采用基因插入和基因取代的方法构建载体： ①花椰菜花叶病毒(Caulimo viruses) ②双联体病毒 ③RNA病毒 ①花椰菜花叶病毒(Caulimo viruses) CaMV的基因组由一个8kb的松弛的环状分子组成。基因组有两个区域，一个是ORFⅡ，编码昆虫传播因子；另一个是ORFⅦ，功能还不清楚。 将这两个区域缺失掉，用感兴趣的基因取代之。Brisson等(1984)用CaMV载体在芜青甘蓝细胞中获得了由细菌二氢叶酸还原酶基因编码的外源蛋白。这一结果证明CaMV基因组确实能被改建成植物基因工程病毒载体并把外源基因转入植物细胞。 已报道的克隆到CaMV载体中的基因都只有较短的核苷酸序列，插入位点都在ORFⅡ上，外源基因的表达多受病毒启动子的调节。 ②双联体病毒 双联体病毒组中的每个成员均需具备两个元件，尽管这两个元件不必存在于同一个分子上，但它们必须是任意有功能的双联体病毒载体系统的组成部分。这两个元件就是一个复制起点和一个病毒复制必需蛋白。 到目前为止，大多数双联体病毒载体都很简单，只缺失外壳蛋白编码基因，可用报告基因或其他感兴趣的基因取代。 双联体病毒表达载体可以用于原生质体、培养细胞、叶圆片及植物体等几种不同系统中外源基因的转移、扩增及表达。 ③RNA病毒 RNA病毒大致可分为三类: 第一类为单链RNA病毒，包括两种基本形式。一种形式是单一型病毒(monopartite)， 其基因组RNA包括全部遗传信息，当作为一个单顺反子被翻译时通常很大，如烟草花叶病毒(TMV)。另一种形式是混合型病毒(multipartite)，正如其名称所示，基因组RNA分为若干部分，每一部分或被包装在同一个颗粒中或被包装在不同的颗粒中，如雀麦草花叶病毒(BMV)三个独立的颗粒包含了四个RNA分子。 第二类即亚基因组RNA(如BMV的RNAⅣ)，它们不可能被用作载体，因为它们在感染植物中不能自我复制。 第三类为卫星RNA，最有可能被用作载体，因为它对病毒完全是可有可无的。 第三节 外源基因导入到植物受体的方法 原生质体介导法 基因枪法 根癌农杆菌介导法 一、原生质体介导法 概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或 物