第三章酶工程-酶的分离纯化.pptVIP

第三章酶的分离纯化 第一节 酶的提取 （一）机械破碎法 （二）物理破碎法 （三）化学破碎法 （四）酶学破碎法 二、酶的提取 （二）酶提取过程中的注意事项 第二节 酶的提取过程中常用的技术 离心是指借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术 温度和pH对酶的活性的影响 是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀出来，达到与其他溶质分离的目的。 蛋白质分子上的电荷与疏水区 蛋白质在等电点的溶解度最小 蛋白质分子上的电荷与疏水区 蛋白质在等电点的溶解度最小 1.凝胶层析 2.亲和层析 3.离子交换层析 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 O’Farrell的蛋白质双向电泳 pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用 1.吸附层析2.凝胶层析3.离子交换层析 4.亲和层析 （三）常用的层析方式 又称分子筛层析，凝胶过滤或分子排阻层析，是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中个组分的相对分子质量不同而进行分离的技术。 概念 分配系数Ka Ka=(Ve-Vo)/V1 Ve:洗脱体积 Vo:外体积 Vt:内体积 凝胶的选择与处理 是利用生物分子对之间所具有的专一性而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。 载体 配基：底物、竞争性抑制剂、辅酶 酶 利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离的方法。 离子交换层析原理 离子交换剂的选择 阴离子交换剂 阳离子交换剂 离子交换剂的处理 离子交换剂的操作过程 装柱 上柱 洗脱收集 再生 （四）层析系统 实验室用层析柱 工业用层析柱 ? 0.5-5 cm ? 5-100 cm 四、萃取分离 混合液中各组分在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。 1.有机溶剂萃取2.双水相萃取 3.超临界萃取4. 反胶束萃取 （一）有机溶剂萃取 利用溶质在水和有机溶剂中的溶解度不同而达到分离萃取的目的 水相 有机相 （二）双水相萃取 利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离萃取的目的 水相 水相 1.1%右旋糖酐溶液0.36%甲基纤维素溶液 0.39%右旋糖酐溶液0.65%甲基纤维素溶液 （三）超临界萃取 超临界流萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术 （四）反胶束萃取 利用反胶束将酶或其它蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离技术。 E E 五、电泳分离 1.纸电泳2.薄层电泳 3.凝胶电泳4.等电聚焦电泳 凝胶电泳 以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。由于凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重租用，故具有很高的分辨率。 1.连续凝胶电泳2.不连续凝胶电泳 3.浓度梯度凝胶电泳4.SDS凝胶电泳 * 一、细胞破碎 通过机械运动所产生的剪切力，使组织细胞破碎的方法称为机械破碎法。 1.机械捣碎法 2.研磨法 3.匀浆法 匀浆法 组织捣碎机 珠磨式组织研磨器 通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法统称为物理破碎法。该方法多用于微生物细胞的破碎。 1.温度差破碎法 2.压力差破碎法 3.超声波破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法。 1.有机溶剂处理：利用有机溶剂可使细胞膜的磷质结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞外。 2.表面活性剂处理：表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜的通透性。 在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎。 1.外加酶处理：根据细胞外层结构的特点，选用适当的酶，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。 2.自溶法：将细胞在一定的pH和适宜的温度条件下保温一段时间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏，使胞内物质释放出来的方法。 在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提。 1.盐溶液提取 2.酸溶液提取 3.碱溶液提取 4.有机溶剂提取 （一）主要方法 1.温度 2.pH 3.提取液的体积 4.添加保护剂 一、离心分离 （一）离心机的种类及用途 1.常速离心机：8000r/min,1x104g 2.高速离心机：1x104~2.5x104r/min, 1x104~1x105g 3.超速离心机：2.5x104~8x104r/min, 5x105g （二）离心方法的选择 1.差速离心：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。 2.密度梯度离心：密度梯度的离心是样品在密度梯度介质