第四章酶的分离纯化.ppt

b. 吸附剂 亲水性（如 Sepharose） 基质 固定相 疏水性（如硅胶、树脂） 配体 （疏水性基团）（苯基、辛基、烷基） 产品名称 载体 配基 生产公司 苯基Sepharose 4B 琼脂糖凝胶珠 苯基 Pharnacia 辛基 Sepharose 4B 琼脂糖凝胶珠 辛基 Pharnacia 烷基交联琼脂糖凝胶珠 琼脂糖凝胶珠 烷基(Cn) 以 色 列 一些商品疏水层析介质 c. 操作 1） 加样：样品溶液中补加适量的盐。 2） 洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。 3） 再生：除去固定相吸附的杂质 ，用水或 8mol/L 脲素溶液 。 4. 应用 主要用于分离纯化大分子物质。 （5）亲和层析(Affinity Chromatography) 由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。 又称： 功能层析（function chromatography） 生物专一吸附（biospecific adsorption） 选择层析（selective chromatography） a.原理 利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。 将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将欲分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。 + C C C 配基 蛋白质 1.配基固相化 2.亲和吸附 固体载体 3.解吸附 Affinity chromatography b. 基质的选择 理想的基质应满足以下要求： ① 高度的亲水性。 ② 极低的非特异性吸附性（惰性）。 ③ 具有足够的化学基团。 ④ 适当的多孔性。 ⑤ 较好的理化稳定性。 可被应用的基质（载体）： （按性能优劣排序） 琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。 最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到10B c. 配体的选择 一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。 优良配体须具备的条件： 1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。 所要分离的目的产物 相应的配基 酶 抗体 凝集素 激素 底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白 目的产物与相应的配基 d. 偶联（亲和吸附剂的制备） 配体一定，改造载体（基质） 1）基质活化： 不同的载体活化需要不同的活化剂。 常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。 溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。 如用CNBr 作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基 2）引入连接臂（space arm） 又称手臂（spacer ） “接臂” 的目的： 克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。 “接臂”的途径： 常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sepharose 4B 常用手臂 e. 操作： 1） 层析前：制备亲和层析剂 选择 根据欲分离物质特性 配基 选择 根据配基分子大小及基团特性 载体 2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。 包括：非专一性洗脱和专一性洗脱 偶联 亲和层析剂 非专一性洗脱： 改变温度 改变pH值 改变离子强度 专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制 剂、底物类似物） 被吸附物质结合 竞争性地与 配体结合 f. 应用 1) 纯化大分子物质 如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose 4B 2) 研究酶的结构与功能： 分离