生物化学___过氧化氢酶Km值测定.pptVIP

过氧化氢酶米氏常数的测定 生物化学实验 牛卫宁 一、实验目的 了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。 学习一种测定酶Km值的方法 熟悉和掌握过氧化氢酶活性的测定原理和方法 二、相关知识与原理 米氏方程与米氏常数（Km值） 米氏方程 Km值: 酶促反应速度为Vmax/2时的 底物浓度。单位是mol/L Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── 相关知识 Km值的含义 Km值是酶的特征性常数之一 Km值可近似表示酶对底物的亲和力 同一酶对于不同底物有不同的Km值 测定Km是研究酶的一种重要方法，大多数酶的Km值在0.01∽100mmol/L之间。 双倒数作图法 Vmax[S] Km+[S] V = 两边同取倒数 （林－贝氏方程） + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S] 绘制1/[S] 与1/V的标准曲线，其与X轴的交点即为－1/Km ，以此求得该酶在测定条件下的Km值。 Km值的测定方法 实验原理 过氧化氢酶催化2H2O2 2H2O+O2 ↑ 反应一定时间后，剩余过氧化氢进行下述反应 2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O 用KMnO4滴定可求出反应前后H2O2的浓度差即反应的速度。 用不同的H2O2的起始量代表同一体系不同时刻的底物浓度。 根据不同的底物浓度和对应的反应速度绘制标准曲线。 从坐标图上读出-1/Km，计算Km值。 1、0.02mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.0 ）。 2、0.02mol/LKMnO4：称取 KMnO4 3.2 g，加蒸馏水 1000 mL，煮沸15 min，2d后过滤，棕色瓶保存 3、0.004mol/L KMnO4：称取恒重草酸钠0.2 g，加 250mL冷沸水及10mL浓硫酸，用0.02mol/L KMnO4 滴定至至微红色，加热至65 ℃，继续滴定微红色30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。 三、试剂 4、0.05mol/L H2O2:30% H2O2 23ml 加入1000ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，用 0.004mol/L KMnO4 标定其准确浓度 (标定前稀释4倍，取2mL，加25% H2SO4 2mL，用0.004mol/L KMnO4 滴定至微红色)。(标定0.05 mol/L H2O2的实际浓度为0.053mol/L) 5、25% H2SO4 5Na2C2O4+2KMnO4+8H2SO4=10CO2↑+2MnSO4+K2SO4+8H2O+5Na2SO4 1、酶液的制备： 每组(共分6组)称取马铃薯5g，加磷酸缓冲液 10mL，研钵匀浆，滤纸过滤。 四、实验步骤 2、反应速度的测定：取干燥的50-100ml锥形瓶6只，编号后按下表操作： 试剂（mL） 0 1 2 3 4 5 H2O2溶液/mL 0 1.00 1.25 1.67 2.50 5.00 蒸馏水/mL 9.5 8.50 8.25 7.83 7.00 4.50 酶液/mL 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 先加好0.053mol/L H2O2和蒸馏水，加入酶液后立即混合摇匀并计录时间，各瓶准确静置5分钟后，立即加入25% H2SO4 2.0mL，边加边摇，以终止酶促反应。最后用标准0.004 mol/L KMnO4滴定剩余的H2O2至微红色，记录各瓶耗KMnO4的mL数。 3、实验数据收集（根据实验进程填写下表） 项目 0 1 2 3 4 5 ①加入H2O2的mL数 ②KMnO4的用量 ③加入H2O2的mmol数 ④剩余H2O2的mmol数＝②×0.004×2.5 ⑤反应速度＝③－④ ⑥底物浓度[s]＝③÷10 ⑦1/v=1÷⑤÷5 ⑧1/[s]=1÷⑥ 注意事项 反应瓶中H2O2浓度计算： 〔S〕＝H2O2摩尔浓度×加入H2O2的mL数 10 ＝加入H2O2的摩尔数 10 ＝ （mmol/mL） 反应速度的计算 V = 加入的H2O2的毫摩尔数－剩余的H2O2的毫摩尔数/5min = H2O2的摩尔浓度×加入H2O2毫升数－0.004×2.5×消耗KMnO4的ml数/5min 注意硫酸和高锰酸钾使用安全！ 酶米氏常数的测定会受到那些实验条件的影响？ 思考题